猪9型链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究

张振江，杜毅超，任鹏飞，陆晨阳，霍孔林，唐海波，刘金凤，吴健敏*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西兽医研究所，广西南宁 530001)

链球菌(Streptococcus)可感染人、猪、牛、羊等，是一种重要的人畜共患病病原体，其主要传播方式为经口或呼吸道传播，也可垂直传播。猪链球菌(Streptococcussuis)是一种革兰阳性菌，对任何品种、年龄及性别的猪均易感[1]，可引起脑膜炎、关节炎、多发性浆膜炎、败血症、肺炎和猝死等[2]。目前，链球菌有35种血清型，其中1、2、7、9型是猪的主要致病菌，以2型流行最广，致病性最强，其次为7型和9型。致病性猪链球菌主要的毒力因子有荚膜多糖(capsular polysaeeharide,CPS)、溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)、胞外蛋白因子( extracellular protein factor,EF)、溶血素(suilysin,Sly)、谷氨酸脱氢酶(glutamic acid dehydrogenase,GDH)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白( fibronectin-and fibrinogen-binding protein，FBPS)和毒力相关基因(orf2)等，我国目前流行的2型强毒株是同时具有上述7种毒力基因的高致病性菌株[2]。

2016年10月初，广西玉林某猪场保育猪突然采食下降或废绝，精神萎靡，随后10多头猪死亡，大部分为中等膘情猪。为确诊疫情，本实验室对送检死猪进行剖检，然后进行细菌分离鉴定、药敏试验及致病性、毒力因子、耐药性检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 广西玉林市某猪场45日龄病死仔猪的病料。

1.1.2 主要试剂 普通营养肉汤，北京陆桥技术股份有限公司产品；细菌微量生化管、药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司产品；电泳凝胶回收试剂盒，北京康为世纪公司产品；DNA Ladder Marker、PCR Mix，TaKaRa公司产品；血琼脂培养基(50 mL/L山羊血),广西兽医研究所按常规方法配制；其他常规试剂均为分析纯。

1.1.3 实验动物 昆明小鼠16只，体重20 g±2 g，购于广西医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化 病死猪剖检特征为脑膜充血和出血，关节肿胀并有积液，脾肿大呈深红色和边缘出现褐色梗死区域。无菌取病猪的心、脑、脾脏制成匀浆，与关节液一起分别划线接种血琼脂平板和普通营养琼脂平板，37℃培养24 h后，观察菌落颜色和形态特征，并挑取形态特征一致的优势菌落进行革兰染色、镜检及纯化，并将菌种接种于营养肉汤中备用。

1.2.2 生化试验 将分离纯化的菌株接种于山梨醇、水杨素、β半乳糖苷、马尿酸盐、七叶苷、甘露醇、松三糖、乳糖、核糖、甘露糖、棉籽糖、山露醇、阿拉伯糖、精氨酸双水解酶和精氨酸脱羟酶等细菌生化反应管，按说明书进行操作，依据伯杰细菌鉴定手册对各生理生化反应结果进行判定[3]。

1.2.3 16 S rDNA序列测定及分析 按常规方法提取菌株的基因组DNA并作为模板，参照文献[4]合成16 S rDNA基因通用引物进行PCR扩增。引物序列为：PF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；PR：5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′；回收PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果用BLAST进行同源性比对，选取同源性较高的部分菌株16 S rDNA参考序列(表1)，用MEGA 6.0软件中Neighbor-Joing(NJ)法构建系统发育树，进行遗传进化分析。

表1 参考序列

1.2.4 PCR分型检测 用已提取的基因组DNA为模板，参照文献[5-6]根据猪链球菌不同血清型菌株荚膜多糖cps基因的特异性设计引物，用于猪链球菌1、2、7、9型的鉴定(表2)。PCR反应体系为25 μL，分别为PCR Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、引物各0.5 μL、模板DNA 2 μL，各种引物的退火温度参照表2，退火时间为45 s。PCR反应结束后，进行电泳并记录结果。

表2 猪链球菌鉴定所用引物

1.2.5 药敏试验及耐药基因检测 药敏试验根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards lnstitute,CLSI)所推荐的Kirly-Baue纸片扩散法[7-10]进行，判定分离菌株对药物的敏感性。

耐药基因检测参照文献[4]用PCR进行，检测头孢菌素类、大环内脂类、青霉素类、氨基糖苷类、氯霉素类、喹诺酮类、四环素类及磺胺类药物耐药基因的共8大类18种耐药基因的存在情况。

1.2.6 毒力因子的测定 参照文献[2,11]选择猪链球菌的主要毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、荚膜多糖基因(cps)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(FBPS)、溶血素(Sly)及毒力相关序列(orf2)设计引物(表3)，进行PCR检测。反应体系为25 μL，包括PCR Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、引物各0.5 μL、模板DNA 2 μL，各种引物的退火温度参照表3。PCR反应结束后，进行电泳并记录结果。

1.2.7 小鼠致病性试验 将分离菌株接种普通营养肉汤，37℃恒温箱培养24 h后，进行细菌计数。然后将16只昆明小鼠随机分为4组，每组4只，1组～3组分别通过腹腔注射稀释梯度为原液、10-1、10-2的细菌稀释液，0.3 mL/只。第4组每只腹腔注射等量的生理盐水，连续观察1周，观察小鼠发病及死亡情况，分析分离菌株的致病性。

表3 毒力基因引物序列

2 结果

2.1 分离菌的形态特征

将病猪的心、脑、脾脏匀浆和关节液分别划线接种于血琼脂平板和普通营养琼脂平板，经培养在血琼脂平板上生长出针尖大小、灰白透明、表面光滑的圆形菌落。将分离菌纯化后染色、镜检观察为革兰阳性菌，并以多个圆形或卵圆形构成的短链形式存在(图1)。

图1 分离菌革兰染色观察 (100×)

2.2 生化特性的鉴定

将纯化后分离菌分别进行生化检测，结果分离菌株糖、醇发酵能力及各种生化鉴定结果均与猪链球菌(Streptococcussuis)生化特性完全一致(表4)。

2.3 16 S rDNA序列鉴定和进化树分析

以分离菌株DNA为模板，采用16 S rDNA通用引物进行PCR扩增，获得大小约1.3 kb片段，经BLAST比对，与猪链球菌序列GZ0565(CP017142)同源性高达99.9%，进一步与GenBank中猪链球菌的16 S rDNA序列进行比对分析，构建系统发育树(图2)，结合分离菌株的形态特征及生理生化特性，确定分离株为猪链球菌，并命名为StreptococcussuisYL1689。

表4 分离株的生理生化特征

注：+.阳性;-.阴性。

Note: +.Positive； -.Negative.

2.4 猪链球菌的分型鉴定

以猪链球菌的分型特异引物来进行PCR扩增，结果猪链球菌1、2、7型均未扩出目的条带，但猪链球菌9型扩增出目的条带，表明该分离株为猪链球菌9型(图3)。

2.5 药敏试验和耐药基因的测定

分离菌药敏试验和耐药基因检测结果见表5。由表5可见，YL1689菌株对呋喃妥因、环丙沙星、头孢哌丁等11种药物高度敏感，对头孢西丁、链霉素、万古霉素等3种药物中度敏感，对苯唑西林、氨曲南、卡那霉素、复方新诺明、多黏菌素B、林可霉素等8种药物完全耐药。在8大类18种耐药基因中tetO(四环素类)、aph-(3)-lia(氨基糖苷类)、SulⅢ(磺胺类)、parC(喹诺酮类)检测结果为阳性，药敏试验和耐药基因的检测结果基本符合。

图2 分离菌16 S rDNA基因系统发育树

M.DNA 标准DL 1 500;1.1型；2. 2型；3. 7型；4. 9型；5.空白对照

M.DNA Marker DL 1 500;1.Type 1;2.Type 2;3.Type 7;4.Type 9;5.Blank control

图3猪链球菌1、2、7、9型的PCR鉴定

Fig.3 PCR identification ofStreptococcussuistypes 1,2,7,9

2.6 毒力基因的测定结果

以PCR的方法测定YL1689菌株的毒力基因。结果cps9H、orf2、gdh、fdps为阳性，epf、sly、mrp为阴性(图4)。由此可见,YL1689菌株毒力基因表型为cps9H+gdh+fdps+epf-sly-mrp-orf2+。

2.7 小鼠致病性试验

将YL1689菌株接种普通营养肉汤，37℃恒温箱培养24 h 后，细菌计数为2×108CFU/mL，攻毒24 h后小鼠开始发病，表现为精神萎靡，食欲不振，四肢痉挛导致全身颤抖，注射原液的小鼠72 h内全部死亡，其他攻毒组7 d后逐渐恢复精神状态，又持续观察数天未见死亡，对照组7 d内未见异常。将死亡小鼠剖检，发现其脾脏、肾脏、肝脏出血肿大，胸腔及脑有积液，无菌接种于50 mL/L羊血琼脂培养基上，形态特征一致，PCR检测鉴定为猪链球菌。

3 讨论

本试验从患病猪体内分离到1株病原菌，经形态学观察和生理生化鉴定确定该菌株为链球菌科、链球菌属。16 S rDNA测序及BLAST比对结果显示,该病原菌为猪链球菌。通过PCR对荚膜多糖(cps)基因的检测证明该菌株为猪链球菌9型。在小鼠致病性试验中，参照Wei Z G等[12]的方法进行毒力判定,结果注射5×108CFU/只剂量组，半数(含)以上死亡的判为强毒(HV)；注射3×109CFU/只剂量组，半数(含)以上死亡的，5×108CFU/只剂量组，半数(不含)以上未死亡的，判为中等毒力(MV)；3×109CFU/只剂量组，半数(不含)以上未死亡的，判为低毒力(LV)。本试验以2×108CFU/mL，0.3 mL/只(实际注射量为6×107CFU/只)对小鼠进行腹腔注射，就可以致小鼠100%死亡，据此可以判定本试验分离的猪链球菌为强毒株。因此，可以诊断此次疫情是猪群感染了猪链球菌血清9型强毒株引起的。

从药敏试验及耐药基因检测结果来看，本试验分离的猪链球菌对苯唑西林、氨曲南、复方新诺明、林可霉素、米诺环素、多黏菌素B等药物完全耐药，对头孢西丁、链霉素、万古霉素等3种药物中度敏感。在耐药基因测定时也检出存在tetO(四环素类)、aph-(3)-lia(氨基糖苷类)、SulⅢ(磺胺类)耐药基因，与该菌株的耐药谱基本一致。由于该菌株对苯唑西林完全耐药，对万古霉素敏感性降低与人医临床上的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)类似，常表现为多重耐药应引起高度重视。相关的报道也显示近年来血清9型猪链球菌在国内的分离率也呈上升趋势[11]，而本试验发现一株具多重耐药的9型链球菌菌株，因此加强对9型猪链球菌及其耐药性的监测十分必要。

表5 分离株的药敏试验及耐药基因检测结果

注：S.高敏(d>15 mm)； I.中敏(10 mm≤d≤15 mm)； R.低敏或不敏感(0 mm≤d<10 mm)； +阳性； -.阴性。

Note: S.High sensitivity(d>15 mm)；I.Moderate sensitivity(10 mm≤d≤15 mm)； R.Low or no sensitivity(0 mm≤d<10 mm);+.Positive;-.Negative.

M.DNA 标准DL 1 500;1.cps9h；2.epf；3.siy；4.orf2；5.mrp；6.gdh；7.fdps

M.DNA Marker DL 1 500;1.cps9h；2.epf；3.siy；4.orf2；5.mrp；6.gdh；7.fdps

图4分离菌株毒力基因检测结果

Fig.4 Detection of virulence genes in isolated strains

相关研究表明,猪链球菌的主要毒力因子有7种，在致病性菌株中毒力基因mrp和epf有很高的检测率，而非致病菌株中检出率极少，作为判断致病性的指标之一[13-14]，欧美等国家认为致病性最强的基因型为cps+epf+mrp+sly+。修福晓[15]在研究猪链球菌9型毒力基因时发现7株国内分离株均具有cps9H、gdh、fdps，缺失sly、epf，而由猪脑脊髓液分离株orf2为阳性，其他健康猪扁桃体分离株缺失orf2。本试验分离株YL1689毒力基因为cps9H+gdh+fdps+epf-sly-mrp-orf2+，与所报道的猪脑脊髓液分离株毒力基因型基本相同。本分离株虽然缺失致病性最强的epf、mrp、sly毒力基因，但在小鼠致病性试验中亦表现很强的致病力，且该菌株还能引起猪的脑膜炎，因此对猪链球菌9型致病机理的研究仍需进一步加强。

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