腹泻犊牛感染的隐孢子虫种类鉴定及基因分型

张会军，刘婷丽，范现成，林 青,2*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海西宁 810016)

隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)是一种重要的机会性致使人和多种动物严重腹泻的肠道寄生原虫[1]。以引起腹泻为主要临床特征的隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)能在人畜间传播，严重危害人和动物的健康甚至导致幼儿和犊牛的腹泻死亡，具有重要的公共卫生学意义。近年来，陕西省大力发展畜牧业并将其作为重点发展的产业之一，奶牛产业得到了长足的发展。但是频繁的跨地域引种促使了人畜共患病原的扩散，对人和动物造成潜在威胁。牛感染隐孢子虫后，粪便会污染水源和食物，通过“粪-口”途径引起隐孢子虫病的流行暴发[2-3]。目前，在陕西省已有牛感染安氏隐孢子虫(C.andersoni)、牛隐孢子虫(C.bovis)、瑞氏隐孢子虫(C.ryanae)的相关报道[4-6]，但尚未见有关在陕西省有牛感染微小隐孢子虫(C.parvum)的报道。

2017年5月，陕西省眉县某奶牛场有犊牛发生严重腹泻。牛场的工作人员先后饲喂了痢菌净、卡那霉素、吡喹酮等药物，并且给予口服补液盐，但未取得明显效果。为明确腹泻犊牛是否存在隐孢子虫感染的情况，本研究分别基于18 S rRNA和60 ku糖蛋白(60 ku glycoprotein，GP60)两个基因位点进行隐孢子虫的分子生物学检测[7]，以确定致使犊牛腹泻的可能原因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源及牛场情况 本研究所用的3份样品来自于某奶牛场的腹泻犊牛。该奶牛场的犊牛(6月龄以内)出现剧烈腹泻，粪便呈淡黄色牛奶状，腹泻犊牛食欲下降，多卧少立，精神沉郁。犊牛腹泻发生后，牛场先后给犊牛饲喂了痢菌净、卡那霉素、吡喹酮等药物，期间穿插饲喂口服补液盐，但腹泻症状未取得明显好转。将所采集的粪便样品装入样品袋内，并详细记录年龄、品种、地理位置、日期等信息，放入冰袋，速回实验室备检。

1.1.2 试剂 粪便基因组E.Z.N.A.®DNA提取试剂盒，OMEGA公司产品；10×ExTaqbuffer(不含Mg2+)、ExTaqDNA聚合酶、r-Taq酶、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2、6×Loading buffer、DNA Marker DL 2 000、溴化乙锭，宝生物工程(大连)有限公司产品；琼脂糖，上海英潍捷基贸易有限公司产品。

1.1.3 引物 所使用的隐孢子虫18 S rRNA和GP60基因的引物(表1)及反应程序参照文献[8]。引物均由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

1.1.4 仪器设备 HC3018型台式高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；SW-CJ型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；HH-4型恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；C-XP-D型PCR扩增仪，杭州博日科技有限公司产品；DYY-12型电泳仪，北京市六一仪器厂生产；Champ Gel 5000型紫外凝胶成像系统，北京赛智创业科技有限公司产品；AUY220型精密电子天平，上海光学仪器一厂生产；高压蒸汽灭菌锅，上海人和科学仪器有限公司产品；微量移液器，北京大龙兴创公司产品。

表1 隐孢子虫套式PCR引物

1.2 方法

1.2.1 粪便基因组DNA的提取 采集粪便保存在25 g/L重铬酸钾中，取出50 mg～100 mg 粪样到 1.5 mL离心管中，加入蒸馏水清洗样品直到上清透亮，按照 E.Z.N.A.Stool DNA Kit 的说明提取粪便基因组DNA，置-20℃保存备用。

1.2.2 套式PCR扩增 基于18 S rRNA和GP60基因，利用套式PCR对所采集的样品进行隐孢子虫的检测和虫种鉴定。18 S rRNA和GP60基因的反应体系如下。第1轮PCR反应：25 μL反应体系中包括2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2.0 μL MgCl2(25 mmol/L)，10 nmol/L第1轮上、下游引物各1 μL，0.125 μL r-Taq(5 U/μL)酶，1 μL DNA模板，双蒸水补齐至25 μL。第2轮PCR反应除了所用模板为第1轮PCR产物，引物为第2轮上、下游引物外，其余试剂种类与剂量均与第1轮相同。扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃(18 S F1和R1)或58℃(18 S F2和R2)或55℃(GP60)退火45 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 10 min，16℃结束反应。取4 μL第2轮PCR扩增产物在含溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)的10 g/L琼脂糖凝胶电泳结束后，于凝胶成像系统下观察结果。

1.2.3 序列分析和基因分型命名规则 将电泳结果的第2轮PCR产物以及第2轮引物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序仪为ABI PRISM 3730 XL DNA Analyzer(Applied Biosystems，USA)。将18 S rRNA基因位点测得的序列使用软件Clustal X 1.83进行比对并参照图谱校正。然后将校正后的序列，运用BLAST将其与GenBank数据库中的参考序列进行同源搜索。利用MEGA 5.1软件进行种系发育关系分析确定每份阳性样品所属的隐孢子虫种类，采用邻接法(Neighbor-joining)、自展值为1000、Kimura 2-parameter模型，并以Plasmodiummalariae(GenBank accession number AB489194)为外群。以GP60基因作为区分C.parvum基因亚型的分子标记，根据已明的规则，亚型以种属和亚型家族名称开头，C.parvum以Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd等命名。亚型家族名称后缀以TCA、TCG或TCT重复序列的重复次数，分别以A、G、T加数字表示，其他重复序列用R加数字表示[4，9-10]。

2 结果

2.1 18 S rRNA的PCR扩增结果

用18 S rRNA的基因位点对陕西眉县某奶牛场腹泻犊牛采集的3份粪便样品进行DNA提取和PCR扩增，3份样品均扩增出830 bp左右大小的目的片段(图1)，说明3份粪便样品中均含有隐孢子虫。

M.DNA 标准 DL 2 000；C.阴性对照； 1～3.粪便样品

M.DNA Marker DL 2 000；C.Negative control；1-3.Fecal samples

图1隐孢子虫18 S rRNA基因PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplication results ofC.parvum18 S rRNA

2.2 隐孢子虫的种系发育分析

基于隐孢子虫的18 S rRNA基因进行序列分析并构建遗传进化树(图2)。结果显示，3份腹泻犊牛隐孢子虫阳性样品中，与GenBank数据库中的C.parvum具有99%以上的序列相似性。种系发育关系分析显示，3份样品全部与C.parvum位于同一进化枝上，而且具有较高的节点支持值(>95%)。以上分析结果表明，本次所采集到的 3份腹泻犊牛粪便样品中，均含有C.parvum。

图2 微小隐孢子虫分离株在18 S rRNA基因位点上的种系发育关系

2.3 GP60的PCR扩增结果

使用GP60基因位点对所采集的粪便样品进行PCR扩增，3份样品均扩增出850 bp左右大小的目的片段(图3)。基因分型结果表明，所采集的3份粪便样品全部为Ⅱd型微小隐孢子虫，且本次检测的3份粪便样品中，2份为ⅡdA30G4，1份为Ⅱd A34G4。

M.DNA 标准 DL 2 000；C.阴性对照； 1～3.粪便样品

M.DNA Marker DL 2 000；C.Negative control；1-3.Fecal samples

图3隐孢子虫GP60基因PCR扩增结果

Fig.3 PCR amplication result ofC.parvumGP60 gene

3 讨论

在全球，养牛场中隐孢子虫的分布非常普遍，但由于环境因素和人为因素的差异，其隐孢子虫的分布情况也存在很大的不同。奶牛特别是犊牛感染隐孢子虫的现象十分普遍，C.parvum是感染的主要隐孢子虫种类之一。有研究表明，犊牛在断奶后会有一定的应激反应[11-13]，而且断奶后由于犊牛不能从母体获得母源抗体且自身肠道菌群和消化能力尚未成熟，这就进一步增加了犊牛的感染风险。还有研究表明，流动日益频繁的人和其他动物也是犊牛感染隐孢子虫的重要来源[2-3]。已有研究表明，C.parvum、C.bovis、C.andersoni和C.ryanae是牛体内常寄生的隐孢子虫种类。

本次使用Sulaiman I M等[14]建立的方法，使用PCR成功扩增出隐孢子虫的18 S rRNA和GP60两个基因的部分片段，检测出C.parvum。这是在陕西省眉县某牛场的调查中，首次发现人畜共患的Ⅱd型C.parvum，表明在该牛场中存在人畜共患病的病原——C.parvum。由于这次样本量小且只是针对出现腹泻症状的犊牛进行的检测，还不能完全阐明该牛场隐孢子虫的感染情况与隐孢子虫病的流行情况。在以后的研究中可以进一步加大采样量，以便对陕西省牛场的总体隐孢子虫感染情况进行更为全面的了解，为防控隐孢子虫病提供理论指导。总之，本研究结果可以说明，该牛场腹泻犊牛存在微小隐孢子虫感染的情况，需要加强防范意识，采取相应的防控措施，阻断隐孢子虫在该地区人与牛之间的相互传播。

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