几丁质脱乙酰基酶基因serpentine和vermiform对果蝇发育的影响

姬亚男,张徐波,于荣荣,董玮,张敏*

(1.山西大学 应用生物学研究所,山西 太原 030006;2.山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006)

0 引言

自然界中几丁质的含量仅次于纤维素[1],其主要存在于昆虫表皮、气管和消化器官等部位中,不仅具有维持昆虫特定形态从而保护昆虫的作用,而且可以阻止病原体和外源毒素对昆虫的侵染[2]。但坚硬的几丁质外壳在昆虫发育过程中会限制其生长,因此,昆虫需要合成新表皮并蜕去旧表皮才能发育成熟[3]。在这一过程中,几丁质脱乙酰基酶(chitin deacetylase,CDA)通过脱乙酰基作用将几丁质转化为不同程度去乙酰度的几丁质,即壳聚糖,便于表皮蛋白的结合,生成化学结构更为稳定的蛋白质-几丁质复合体,可以产生更为成熟的昆虫表皮[4]。因此,CDAs在昆虫生长发育中起重要作用。

对于昆虫CDAs的研究,自2005年Guo等首次在粉纹夜蛾(Trichoplusiani)中肠cDNA表达文库中鉴定CDA蛋白,并发现其与围食膜的特性相关且有很强的几丁质结合活性以来,越来越多的昆虫CDAs基因被克隆,且进行了相关的功能研究[5]。黑腹果蝇中(Drosophilamelanogaster),serp(CDA1)和verm(CDA2)基因在其胚胎气管的形成和延伸过程中起重要作用[6-7]。Yasuyuki等研究了赤拟谷盗的9个CDAs基因,采用免疫组化的方法发现TcCDA1蛋白在幼虫气管中有表达,TcCDA6TcCDA9基因在中肠细胞系中表达,采用RNAi技术发现TcCDA1和TcCDA2对其各阶段的蜕皮均有影响[8]。Campbell等在棉铃虫的中肠围食膜中鉴定出CDA蛋白,推测其与其他蛋白共同完成消化酶的固定,以及保护肠道免受寄生虫入侵和拦截毒素的功能[9-10]。本课题组克隆获得了中华稻蝗OcCDA1和OcCDA2基因,采用RNAi技术发现这两个基因在中华稻蝗的蜕皮过程中起重要的作用[11]。上述研究发现,昆虫CDAs基因在昆虫的生长发育中起重要作用,但不同昆虫沉默该基因后影响的虫体发育部位有所差异,因此,利用果蝇便利的Gal4/UAS系统,在不同的组织部位沉默该基因,研究CDAs基因对昆虫各组织部位发育的影响,不仅对我们初步了解该基因在果蝇生长发育中的作用机制提供帮助,也为系统解析昆虫CDA基因的功能提供重要的基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

转基因果蝇品系:uas-verm-RNAi(v15464)和uas-serp-RNAi(v15466)购买于VDRC平台。tub-Gal4和Gal80ts，tub-Gal4来自清华大学。w1118,btl-Gal4(8807),chat-Gal4(BS6793),Aug21-Gal4(30137)购买于Bloomington Drosophila Stock Center。ey-Gal4由华南师范大学李胜教授实验室馈赠。69B-Gal4由德国Bernard教授实验室馈赠。

转基因果蝇的饲养:果蝇培养基选用标准的玉米琼脂糖浆,所有转基因品系均在25℃培养箱培养。

1.2 实验方法

1.2.1 果蝇Gal4/UAS系统

在模式生物黑腹果蝇中,Gal4/UAS系统是构建杂交品系最常见的转基因表达方式。Gal4(Galactose 4)是酵母半乳糖/蜜二糖代谢系统中的转录激活因子,可结合DNA序列UAS(upstream activating sequence)的特异位点并激活其下游基因的表达[12-13]。选取果蝇不同组织部位的Gal4可在果蝇不同组织部位特异性表达uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi,通过在Gal4的表达部位降低serp和verm基因的表达水平,来观察serp和verm基因在果蝇不同组织中的生长发育中的作用。

1.2.2 转基因果蝇杂交品系的构建

(1)挑取全身驱动的Gal80ts，tub-Gal4品系的处女蝇分别与uas-verm-RNAi和uas-serp-RNAi杂交。与uas-verm-RNAi杂交后子一代基因型为Gal80ts,tub-Gal4, uas-verm-RNAi(简写为Gal80ts，tub>verm-RNAi)。因uas-serp-RNAi位于Y染色体上,杂交后子一代挑取雄虫,其基因型为uas-serp-RNAi;Gal80ts,tub-Gal4(简写为Gal80ts,tub>serp-RNAi)。

(2)挑取表皮驱动的69B-Gal4品系的处女蝇分别与uas-verm-RNAi和uas-serp-RNAi杂交。与uas-verm-RNAi杂交后子一代基因型为69B-Gal4;uas-verm-RNAi(简写为69B>verm-RNAi)。因uas-serp-RNAi位于Y染色体上,杂交后子一代挑取雄虫,其基因型为uas-serp-RNAi;69B-Gal4,简写为(69B>serp-RNAi)。

(3)同(2),挑取气管驱动的btl-Gal4品系的处女蝇分别与uas-verm-RNAi和uas-serp-RNAi杂交。获取基因型为btl>verm-RNAi和btl>serp-RNAi的目的后代。

(4)挑取Aug21-Gal4(表达部位为咽侧体)、chat-Gal4(表达部位为神经)和ey-Gal4(表达部位为眼睛)的处女蝇分别与uas-verm-RNAi和uas-serp-RNAi杂交。获取基因型为Aug21>verm-RNAi、Aug21>serp-RNAi、chat>verm-RNAi、chat>serp-RNAi、ey>verm-RNAi和ey>serp-RNAi的目的后代。

(5)挑取野生型WT处女蝇与WT雄蝇进行杂交作为对照组,与实验组处理条件相同。

1.2.3 转基因果蝇杂交品系的处理条件

(1)tub-Gal4的表达部位为全身,在全身分别驱动uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi,所有后代均胚胎期致死。

为了挖掘serp和verm基因在果蝇中的更多信息,引入Gal80ts温控因子对Gal4活力进行控制。即选取Gal80ts,tub-Gal4进行杂交,在全身不同时期进行干扰。

幼虫期干扰:在幼虫期将Gal4活力开启(18℃产卵8 h,18℃孵化48 h后转入30℃),在蛹期停止干扰(从白蛹期开始将目的后代由30℃转入18℃)。

蛹期干扰:在幼虫期将Gal4活力关闭(18℃产卵8 h,18℃孵化至白蛹期),在蛹期开始干扰(从白蛹期开始将目的后代由18℃转入30℃)。

(2)用69B-Gal4,btl-Gal4,ey-Gal4,Aug21-Gal4,chat-Gal4分别驱动uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi后,目的后代均在18℃产卵24 h,18℃孵育24 h后转至30℃恒温培养箱,待羽化(视发育情况而定)后观察表型(对照均选用w1118自交,与实验组同时处理)。

1.3 数据分析

对照组与处理组均同时杂交5管,每管雌雄比为30∶15,到达产卵高峰后控制产卵6 h,产卵后显微镜下观察并数出产卵量。同时观察对照组与处理组果蝇后代,若处理组果蝇在发育过程中发生变化,则取出同组对照和处理组,解剖镜下观察,CCD体视镜下成像;并计算发生表型概率,并用SPSS软件的ANOVA对数据进行分析,LDS法进行多重比较,显著性检验水平为P<0.05,P<0.01为极显著。无变化的个体继续放入30℃。所有对照组与处理组均持续观察至有表型出现或者能够正常羽化。

2 结果及分析

2.1 全身驱动serp和verm基因表达下降对果蝇生长发育的影响

采用tub-Gal4分别驱动uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi,所有后代均胚胎期致死。为了观察到更多的表型,引入Gal80ts温控因子对Gal4进行表达时期的调控,结果发现:1)在幼虫期将果蝇放入30℃培养开启干扰后,其大部分目的后代在幼虫期即死亡,仅有少数后代能发育到蛹期,但并不能完成羽化,在蛹期不同阶段死亡。其中,Gal80ts,tub>serp-RNAi的后代中,有24%的幼虫可以化蛹,但是其死亡时期不同(图1F),其中16%的个体发育至蛹前期(第三天蛹)死亡(图1D),8%的个体发育到蛹后期死亡(图1E)。而Gal80ts,tub>verm-RNAi的后代中,仅有6%的个体能发育到蛹后期,不能破羽化,或者停止发育直至死亡(图1C)。蛹期死亡的个体出现两种表型,一种是发育至蛹后期滞育而死(图1G是所有后代的5%),另一种是发育至蛹后期,蛹壳开裂,成虫不能正常羽化出壳而死(图1H是所有后代的1%)。幼虫期干扰CDAs后,其致死率与对照相比极显著(P<0.01)(图1C),表明serp和verm基因在果蝇幼虫期的正常表达对其生长发育有重要作用。2)在蛹期将果蝇放入30℃培养,开启serp和verm基因干扰后,其后代也不能正常羽化,Gal80ts,tub>serp-RNAi后代分别在蛹后期和羽化时死亡(图2E),其中有18%的个体发育到羽化时,不能正常羽化而死亡(图2D),剩余82%的子一代均在蛹后期致死(图2C)。而Gal80ts,tub>verm-RNAi后代的致死时期分别为蛹前期(55%,图2F和2H)和蛹后期(45%,图2G和2H)。表明果蝇的生长发育需要serp和verm基因在其蛹期正常表达才能实现。

A:Pupae 2d of the Wild-type Fruit fly (dorsal part)；B:Pupae 4d of the Wild-type Fruit fly (dorsal part).C:The percentage of Gal80ts tub>CDAs phenotype on larval stage.(Significance test level was P<0.05,P<0.01 was highly significant difference)；D,E:Phenotype of Gal80ts ,tub>serp-RNAi on larval stage；F:Percentage statistics of different phenotypes of Gal80ts, tub>serp-RNAi on larval stage；G,H:Phenotype of Gal80ts ,tub>verm-RNAi on larval stage；I:Percentage statistics of different phenotypes of Gal80ts ,tub>verm-RNAi on larval stageFig.1 Interference phenotype observed in Gal80ts,tub>CDAs on larval stageA:野生型果蝇第2天蛹(背面) B:野生型果蝇第4天蛹(背面);C:Gal80ts,tub>CDAs表型所占百分比统计(显著性检验水平为P<0.05,P<0.01为极显著差异);D,E:Gal80ts,tub>serp-RNAi幼虫期干扰的表型观察;F:Gal80ts, tub>serp-RNAi在幼虫期不同表型所占百分比统计;G,H:Gal80ts, tub>verm-RNAi幼虫期干扰的表型观察;I:Gal80ts ,tub>verm-RNAi在幼虫期不同表型所占百分比统计;图1 Gal80ts, tub>CDAs幼虫期干扰的表型观察

A:Pupae 4d of the Wild-type Fruit fly(dorsal part);B:The pupae 2d of the Wild-type Fruit fly(dorsal part);C,D:The phenotype of Gal80ts,tub>serp-RNAi on pupal stage;E:Percentage statistics of different phenotypes of Gal80ts,tub>serp-RNAi on pupal stage;F,G:Phenotype of Gal80ts,tub>verm-RNAi on pupal stage;H:Percentage statistics of different phenotypes of Gal80ts,tub>verm-RNAi on pupal stageFig.2 Interference phenotype observed in Gal80ts,tub>CDAs on pupal stageA:野生型果蝇第4天蛹(背面) B:野生型果蝇第2天蛹(背面);C,D:Gal80ts,tub>serp-RNAi蛹期干扰的表型观察;E:Gal80ts,tub>serp-RNAi在蛹期不同表型所占百分比统计;F,G:Gal80ts,tub>verm-RNAi蛹期干扰的表型观察;H:Gal80ts,tub>verm-RNAi在蛹期不同表型所占百分比统计图2 Gal80ts,tub>CDAs蛹期干扰的表型观察

2.2 serp和verm基因对果蝇表皮的影响

用69B-Gal4分别驱动uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi果蝇品系表皮中serp和verm基因的表达下降后,发现69B>serp-RNAi后代的胚胎与对照组相比整个卵壳颜色由晶莹剔透的亮白色变成暗黄色,卵壳质地由柔韧有弹性变为干硬易碎,并且剖开卵膜后发现对照内容物晶莹有光泽而处理组的内容物颜色发黄,最终导致所有个体在胚胎期致死(图3B、3C),表明serp基因在果蝇卵发育阶段起重要作用。而在表皮干扰verm-RNAi后,与对照组比较发现69B>verm-RNAi的后代可以发育至蛹前期,但到达脂溶期后发育停滞,蛹壳内有很多积液,各组织部位均不能发育成型,同时在其蛹腹面尾部出现焦黑状斑点(图3E、3F),表明干扰果蝇表皮部位的verm基因对其发育造成的影响较serp基因稍显温和,虫体可以经过三次褪去表皮的过程发育至蛹,其在蛹期溶解重排幼虫期的组织和器官并形成成虫的组织和器官的阶段起非常重要的作用。

A:Embryo of the Wild-type Fruit fly;B,C: Phenotype of 69B>serp-RNAi(Red arrow in A and B show the embryo content);C:Pupae 2d of the Wild-type Fruit fly (veutro);E,F:The phenotype of 69B>verm-RNAi(Blue arrow in E and F show the black spot on the tail of the pupa)Fig.3 Interference phenotype observed in 69B>CDAsA:野生型胚胎；B,C:69B>serp-RNAi的表型观察(A、B图中红色箭头所指为胚胎内容物);D:野生型果蝇第2天蛹(腹面)；E,F:69B>verm-RNAi的表型观察;(E、F图中蓝色箭头所指为蛹腹面尾部黑斑)图3 69B>CDAs干扰的表型观察

2.3 serp和verm基因对果蝇气管的影响

用btl-Gal4分别驱动uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi,发现在果蝇气管下调serp和verm基因表达后,其后代大部分死于胚胎期和幼虫期,化蛹率很低(图4E)。干扰serp-RNAi后,仅有10%的个体能够化蛹,并且能够发育至蛹后期,观察后可以发现蛹壳已有开口,果蝇不能正常爬出羽化而导致死亡(图4B)。在气管部位干扰verm-RNAi后,其后代中仅有6%的个体可发育至蛹前期,但在脂溶期停止发育,蛹壳内容物为液体,不存在成型的组织器官(图4C)。表明serp和verm基因表达量的降低导致果蝇胚胎和幼虫的气管不能正常发育,造成大部分虫体在胚胎和幼虫期死亡。

A:Pupae 4d of the Wild-type Fruit fly (dorsal part);B:Phenotype of btl>serp-RNAi(Black arrow in figure B represents a crack in the shell of a chrysalis);C:Pupae 2d of the Wild-type Fruit fly (veutro);D: The phenotype of btl>verm-RNAi;E:Percentage of btl>CDAs phenotype;Fig.4 Interference phenotype observed in btl>CDAsA:野生型果蝇第4天蛹(背面);B:btl>serp-RNAi的表型观察(图B中黑色箭头表示蛹壳裂缝);C:野生型果蝇第2天蛹(腹面);D:btl>verm-RNAi的表型观察;E:btl>CDAs表型所占百分比统计图4 btl>CDAs干扰的表型观察

2.4 干扰果蝇咽侧体、神经和眼部位serp和verm基因对果蝇发育的影响

用Aug21-Gal4、chat-Gal4和ey-Gal4分别驱动uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi,发现在果蝇咽侧体、神经以及眼等部位干扰两个CDAs基因后,其后代表型与对照组相同,均可正常羽化为成虫(图5)。表明在几丁质含量少的咽侧体、神经和眼中干扰serp和verm基因表达并不影响果蝇的生长发育。

A,B:Adult of the Wild-type Fruit fly;C:Eyes of the ey>GFP;D:Phenotype of chat>verm-RNAi;E:Phenotype of chat>serp-RNAi；G:Phenotype of Aug21>verm-RNAi;H:The phenotype of Aug21>serp-RNAi；F:Phenotype of ey>verm-RNAi;I:The phenotype of ey>serp-RNAiFig.5 Interference phenotype observed of Aug21-Gal4、chat-Gal4、ey-Gal4 respectively drive uas-CDAs-RNAiA,B:野生型果蝇成虫;C:ey>GFP眼的表型;D:chat>verm-RNAi的表型观察;E:chat>serp-RNAi的表型观察;G:Aug21>verm-RNAi的表型观察;H:Aug21>serp-RNAi的表型观察;F:ey>verm-RNAi的表型观察;I:ey>serp-RNAi的表型观察图5 Aug21-Gal4、chat-Gal4、ey-Gal4分别驱动uas-CDAs-RNAi的表型观察

3 讨论

CDAs基因是碳水化合物酯酶4家族的成员之一,参与多个昆虫生长发育过程[14]。已发现CDAs基因主要参与昆虫围食膜特性、气管形成和延伸以及昆虫蜕皮等重要发育过程[4-7]。本研究初步引入Gal80ts温控因子对全身表达的tub-Gal4分别驱动的uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi果蝇品系进行表达时期的调控,发现在幼虫期开启干扰serp基因的果蝇后代中有24%的个体发育至蛹期死亡,而干扰verm基因的果蝇后代仅有6%的个体可以发育至蛹期,表明serp和verm基因在果蝇幼虫期的正常表达对其生长发育有重要作用,且verm基因在幼虫期的全身调控作用比serp基因的更重要。蛹期全身干扰serp基因的果蝇后代都能发育到蛹后期或羽化时死亡,而蛹期全身干扰verm基因的果蝇后代仅有45%能够发育到蛹后期然后死亡,而其余55%的个体均在蛹前期致死,表明serp和verm基因在果蝇蛹期全身的正常表达对其发育具有重要作用,且verm基因的作用更重要一些。由上述结果可知全身干扰serp和verm基因对果蝇幼虫期造成的影响比蛹期的更严重,表明serp和verm基因在果蝇幼虫期的作用更重要。

CDAs基因在不同昆虫体内的表达部位有差异,如粉纹夜蛾、棉铃虫和蓓带夜蛾的CDAs基因在其中肠围食膜中表达;已报道的果蝇serp和verm基因均在胚胎气管中有表达[3-7],serp基因在果蝇脂肪体中也有表达[15];赤拟谷盗CDA1和CDA2主要在表皮表达,而CDA6-9主要在肠道特异表达[8];家蚕中CDAs基因在幼虫蜕皮时的表皮、气管和中肠等组织中高表达[16]。运用果蝇Gal4/UAS系统诱导serp和verm基因在果蝇不同组织部位低表达,发现降低果蝇表皮和气管部位CDAs基因的表达造成果蝇的生长发育缺陷,最终死亡,而降低果蝇咽侧体、神经和眼部位的serp和verm基因的表达并没有影响果蝇的正常生长发育,说明果蝇CDAs基因在其表皮和气管等几丁质含量较高的组织部位发挥重要作用。

CDA1和CDA2基因在飞蝗和稻蝗的表皮高表达,采用RANi的方法降低CDAs基因的表达后,飞蝗和稻蝗均出现蜕皮致死的现象[17-19]。赤拟谷盗中发现降低CDA1和CDA2基因的表达,会影响其幼虫到幼虫,幼虫到蛹和蛹到成虫的蜕皮过程[8]。本研究中在表皮特异干扰果蝇serp基因的表达后,所有后代胚胎期致死。因为昆虫胚胎的发育也要经历3次蜕皮才能成熟,因此推测serp基因表达下降使得果蝇不能完成胚胎期的蜕皮过程而死亡。在表皮特异干扰verm基因表达,后代可发育至蛹前期,在脂溶期发育停滞,蛹壳内都是液体没有成型的虫体。说明果蝇serp基因在表皮的缺失比verm基因的对果蝇的发育影响时期更早一些,推测serp基因影响了胚胎的蜕皮过程,而verm基因主要影响蛹到成虫阶段的蜕皮过程。

Wang等和Luschnig等采用btl-Gal4在气管特异驱动serp和verm突变体基因表达的果蝇品系后发现其后代胚胎气管与野生型对照组相比更长,认为serp和verm基因在果蝇胚胎气管的形成和延伸中起重要作用[6-7]，且气管为果蝇富含几丁质的部位。因此,本研究用btl-Gal4分别驱动uas-serp-RNAi和uas-verm-RNAi果蝇品系,发现在气管部位干扰serp和verm基因表达后,其后代大部分在胚胎期和幼虫期即死亡,仅有少数个体能够发育至蛹期。推测可能由于果蝇uas-CDAs-RNAi品系的干扰效率达不到100%,导致有少数个体在胚胎期和幼虫期个体的气管能够部分实现其功能而存活下来,但发育至蛹期后,成虫的结构更为复杂,需要更多的氧气维持其生存,但缺陷的气管不能提供充分的氧气而最终导致其在这一阶段死亡。

综上所述,降低CDAs基因在果蝇富含几丁质部位的表达,会导致果蝇死亡,而减少其在几丁质含量低的部位的表达,不会影响果蝇的生长发育,根据几丁质脱乙酰基酶的作用机理推测CDAs基因主要是通过改变昆虫几丁质脱乙酰度改变富含几丁质的组织器官的形态结构来起作用。这一研究不仅丰富了昆虫CDAs基因的研究内容,而且为研发新型、环境友好型杀虫剂提供了新的理论基础和依据。

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