褪黑素受体Mel 1b基因mRNA和蛋白在鸭不同组织中的表达与分布

刘文举，王淑娟，*，刘晓丽，庞训胜，王立克

(1.安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100；2. 华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070)

几乎所有生物体都表现出生理和行为的日常节律，这些节律不仅受外界环境刺激的影响，如日光/黑暗周期，也受内源性生物钟的影响。褪黑素的生产和分泌就表现出昼夜节律，且其可调节人和动物的节律性生理功能。褪黑激素是一种吲哚类神经激素，化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺，是神经内分泌系统的核心。20 世纪中期，Lerner 等[1]首次从牛的松果体中发现、分离并鉴定了该激素。在人和动物体内，褪黑激素主要由脑部的松果体分泌，其他周边组织和细胞中也有部分的分泌。褪黑激素不仅存在于脊椎动物体内，在细菌、单细胞真核生物和植物等生物中也存在，这一发现表明了褪黑激素在生物进化过程中具有多样性。褪黑激素是光照信息同动物日常行为和神经内分泌调节系统协调关系中的重要激素信号，其合成分泌与光照周期同步，呈现极显著的昼夜节律和季节节律。大量临床和实验结果证明，褪黑激素作为内源性神经内分泌激素，对中枢神经系统有直接和间接的生理调节作用，在其他组织中褪黑激素也起到广泛的作用，如调节睡眠和昼夜节律性[2-3]，对免疫系统的调节[4]、抗氧化[5-6]、抗衰老[7]，及对生殖系统的调节作用[8]。褪黑素对动物的生殖调控作用方式主要有间接作用和直接作用。褪黑激素分泌受光照的影响，其通过下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-genital axis，HPG)的信号传导调节季节性繁殖动物的生殖功能，且在下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)释放神经元、垂体前叶结节部、远端促性腺细胞和泌乳细胞、睾丸和卵巢等部位的褪黑激素受体作用下完成[9-12]。研究表明，卵泡中褪黑素的浓度是松果体释放血液中的褪黑素的3倍[13]，进一步说明高浓度褪黑素对卵泡发育有着重要的作用，其可改善卵泡质量，促进卵泡成熟，对胚胎也起到保护作用[14]。褪黑激素生物学作用如此广泛，提示机体中许多组织细胞是其作用的靶位点，褪黑激素发挥作用的第一步是与靶组织上的特异性受体结合，然后通过信号传导系统而产生生物效应，因此研究褪黑激素受体在体内的分布及生物学特性对于阐明褪黑激素的作用机制十分重要。基于此，本实验分析了褪黑素受体Mel 1b在鸭不同组织的表达分布，为研究褪黑素及其受体对鸭生殖功能的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验对象

产蛋期母鸭6只，购于蚌埠种鸭场。颈静脉放血屠宰，30 min内取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、胰脏、胸肌、卵巢组织，于液氮中保存备用。同时取大脑、肺脏、肝脏、胸肌、肾脏、心脏、胰脏组织于4%多聚甲醛固定备用。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂盒、dNTP MixTaqDNA聚合酶等均购自天根生化科技(北京)有限公司(中国)；反转录试剂盒购自MBI Fermentas(立陶宛)；免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(中国)；褪黑素受体Mel 1b多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(中国)；荧光定量试剂盒购自Roche(瑞士)。

1.3 总RNA提取与RT-PCR

取冷冻于液氮中的组织样本各约50 mg，在研钵中研磨成粉末状，然后放入含有裂解液的试管中，充分混合均匀，按照RNA提取试剂盒说明提取总RNA，-80 ℃保存备用。

利用反转录试剂盒将所提取的各组织的总RNA反转录成cDNA。反转录程序和条件依照试剂盒说明进行，所得到的各组织的cDNA置于-20 ℃保存备用。

1.4 引物设计

参照GenBank中原鸡(ID:396338)、斑马鱼(ID:30669)、非洲爪蛙(ID:100493509)的Mel1b基因序列的保守区域，利用Primer 5.0软件优化设计1对引物。将GAPDH基因作为内参基因，其引物序列参照Duckett等[15]设计的引物序列，由上海生物工程有限公司合成，见表1。

1.5 PCR扩增

表1 鸭Mel 1b基因PCR扩增引物序列Table 1 Primers used in Mel 1b gene of duck for PCR

以反转录获得的cDNA链为模板，利用PCR技术进行鸭Mel1b基因和内参基因的扩增，检测不同组织中是否存在Mel1bmRNA的表达。PCR反应体系为：cDNA 1.0 μL，10 mmol·L-1正、反向引物各0.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，5 U·μL-1Taq酶0.5 μL，加ddH2O补至25.0 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物保存在4 ℃。

得到的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察目的片段。如存在目的片段，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，送上海生物工程有限公司进行测序，鉴定基因序列。若回收的DNA片段经测序符合鸭Mel1b基因序列，则按照PCR反应体系和程序检测鸭各组织中Mel1bmRNA的表达水平。

1.6 免疫组化

将4%多聚甲醛固定好的各组织样品用常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，60 ℃恒温箱中烘烤120 min，常规脱蜡至水。按照武汉博士德SABC法免疫组化试剂盒操作步骤，依次滴加抗原修复液、3% H2O2、5%脱脂奶粉封闭液和兔抗Mel 1b多抗，再滴加生物素化山羊抗兔二抗，DAB显色，苏木精复染细胞核1 min，盐酸乙醇分化、脱水、透明、封片。显微镜下观察Mel 1b蛋白的表达情况。

1.7 Real-time PCR

以反转录获得的cDNA为模板，引物见表1，每个样本重复3次。10 μL反应体系中加入5.0 μL含绿色荧光的2×Mix Buffer，2.0 μL cDNA模板，各0.5 μL 10 mmol·L-1的正、反引物，以ddH2O补至10 μL。反应程序见表2所示。

1.8 数据统计分析

表2 Real time PCR 反应程序Table 2 Real time PCR experimental procedure

利用LightCycler 480系统软件分析Real time PCR数据，以大脑组织中Mel1bmRNA表达量为参照，应用 2-ΔΔCt方法分析其他组织中的相对表达量。采用SPSS 11.0软件作统计学分析，数据以平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 鸭各组织总RNA的提取

利用琼脂糖凝胶电泳检测提取的鸭各组织总RNA，结果表明，有两条清晰的条带，分别为28S和18S，且28S条带比18S亮度高，表明提取的RNA质量较好，无降解，可保证后续实验(图1)。

2.2 Mel 1b mRNA组织表达谱

经PCR扩增获得的鸭Mel1b基因，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物大小和预期大小相符，为216 bp(图2)。经测序，其基因序列与GenBank中其他物种的Mel1b同源性很高，属于鸭Mel1b基因。基于此，检测鸭脾脏、心脏、肾脏、大脑、胸肌、卵巢、肺脏、肝脏、胰脏中Mel1bmRNA。结果表明，鸭的各组织中均存在Mel1bmRNA表达，且不同组织中的表达量存在差异性(图2)。

2.3 Mel 1b蛋白组织分布

图1 鸭各组织总RNA琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis map of total RNA in duck tissues

利用免疫组化方法检测鸭Mel 1b蛋白在不同组织中的表达，结果表明，在鸭大脑、肺脏、肝脏、胸肌、肾脏、心脏、胰脏中均有分布，其信号在细胞膜、细胞质和细胞核内均存在，但蛋白信号强度存在差异(图3)。

M，Marker；1-9，脾脏、心脏、肾脏、大脑、卵巢、胸肌、肺脏、肝脏、胰腺。M，Marker；1-9，Spleen，heart，kidney，brain，ovary，breast muscle，lung，liver and pancreas, respectively.图2 Mel 1b基因和内参基因GAPDH在鸭各组织中的表达Fig.2 Expression of Mel 1b and GAPDH gene in duck tissues

A, 大脑；B，肺脏；C，肝脏；D，胸肌；E，肾脏；F，心脏；G，胰脏。A，Brain; B, Lung; C, Liver; D, Breast muscle; E, Kidney; F, Heart; G, Pancreas.图3 Mel 1b受体蛋白在鸭各组织中的分布Fig.3 Distribution of Mel 1b protein in duck tissues

2.4 Mel 1b mRNA组织中的相对表达量

利用Real time PCR方法检测鸭Mel1bmRNA在鸭脾脏、心脏、肾脏、大脑、胸肌、卵巢、肺脏、肝脏和胰脏组织的相对表达量，以GAPDH基因作为内参基因，以大脑内表达量为对照。结果表明，Mel1bmRNA在卵巢中的表达量最多，其次为肺脏，在脾脏、心脏、肾脏和肝脏中的表达量也明显高于大脑中的表达，但在胸肌和胰脏中的表达量稍低于大脑中的表达量(图4)。

3 讨论

褪黑素具有广泛的生物学功能，除具有抗氧化作用外，还可通过与膜受体结合调节昼夜节律和生理功能，如免疫调节、内分泌调节、生殖功能、生物钟等。这些膜受体表达较广泛，在神经中枢系统和外周组织中均有表达，但每个受体亚型的靶组织不同，所以不同部位的功能反应亦不同[16]。对动物而言，更多地关注其对生殖的调控。研究表明，褪黑素可通过下丘脑-垂体-性腺轴调控动物生殖功能，主要是褪黑素可调节下丘脑神经元分泌GnRH，而GnRH控制LH和FSH的生成，同时褪黑素还刺激颗粒细胞分泌黄体酮[17]，抑制雌激素受体表达和雌激素活性[18]。另外，褪黑素亦可直接作用于卵巢功能。研究表明，卵巢内可直接分泌褪黑素，其可调节卵母细胞成熟、胚胎发育[14]和颗粒细胞增殖凋亡[19-20]等。本研究探索了鸭的Mel 1b在不同组织中的表达分布，为进一步研究褪黑素对鸭的生理功能调节作用奠定了良好的基础。采用Real time PCR技术和免疫组化技术研究了Mel1bmRNA和蛋白质在鸭不同组织中的表达分布，表明鸭Mel1bmRNA在脾脏、心脏、肾脏、大脑、胸肌、卵巢、肺脏、肝脏、胰脏中均有表达，且Mel 1b受体蛋白均存在于大脑、肺脏、肝脏、胸肌、肾脏、心脏、胰脏中。本研究未能成功检测Mel 1b受体蛋白在卵巢和脾脏组织中的分布，但有研究表明在其他动物的卵巢和脾脏中存在褪黑素受体蛋白的表达分布[19，21]，推测鸭的卵巢和脾脏中可能亦有褪黑素受体蛋白的分布，有待进一步证实。Real-time PCR结果表明，各组织中Mel1bmRNA表达量存在差异，在卵巢中的表达量最多，其次为肺脏，在脾脏、心脏、肾脏和肝脏中的表达量明显高于大脑中的表达量，但在胸肌和胰脏中的表达量稍低于大脑中的表达量。进一步证实了褪黑素受体参与调节广泛的生物学功能，特别是对生殖功能的调节作用。

*代表与大脑中的表达量相比差异显著(P<0.05)。Symbol * represented a significant difference between the expression level in this tissue and the expression level in the brain (P<0.05).图4 Mel 1b基因mRNA在鸭各组织中的定量表达Fig.4 Quantitative expression of Mel 1b mRNA in duck tissues

本研究成功克隆了鸭Mel1b基因的部分片段，经过NCBI数据库比对分析发现，与其他非哺乳物种Mel1b基因的同源性较高。Mel1bmRNA 在鸭神经组织和周边组织具有广泛的表达，同时Mel 1a受体蛋白在鸭多个组织中也具有广泛表达，并且Mel1amRNA在各组织的表达量也存在差异性。由于Mel 1b和Mel 1a在鸭各组织中的表达分布规律具有相似性[22]，推测该两种受体可能同时介导褪黑素对鸭的广泛的生理功能，但这一推理有待进一步证实。

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