NAD(P)H氧化酶p22phox亚基-A930G基因多态性与上海松江地区汉族人群颈动脉粥样硬化的相关性

于芳苹 李丽敏 赵迎春 张昆仑 杨永益

作为全身普遍动脉粥样硬化的标志之一，颈动脉粥样硬化已被公认为缺血性脑卒中的独立危险因素。动脉粥样硬化是环境与遗传因素共同作用的结果，家族性研究表明颈动脉内膜中层厚度(Intima-media thickness,IMT)受遗传因素影响。酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]氧化酶产生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)诱导的氧化应激反应会损伤血管内皮细胞，发生血管功能障碍，导致动脉粥样硬化斑块的形成，与冠状动脉粥样硬化性心脏病及急性缺血性脑卒中的发生和发展密切相关[1-2]。p22phox亚基作为NAD(P)H氧化酶的重要组成部分在血管细胞活性氧产生过程中起到了关键性的作用[3]。目前研究发现，-A930G基因多态性对NAD(P)H氧化酶p22phox亚基活性影响较大，是高血压病、冠心病等心脑血管疾病发病的危险因素[4-5]。但是，-A930G基因多态性与颈动脉粥样硬化的关系研究甚少。本研究运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)及基因测序技术分析上海地区汉族人群颈动脉粥样硬化与NAD(P)H氧化酶p22phox亚基-A930G基因多态性的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

颈动脉粥样硬化组：选择2015年9月-2016年9月在本院神经内科就诊并伴有颈动脉粥样硬化的患者258例，其中男142例，女116例，年龄35～83岁，平均年龄(67.36±9.36)岁，高血压病165例，伴有脑出血或脑梗死共176例。

对照组：同期颈动脉IMT<1.0 mm的体检健康者共286例，男165例，女121例，年龄31～79岁，平均年龄(65.76±8.36)岁，高血压病95例，有过脑血管意外病史52例，均符合对照组入选标准。

研究对象均选择上海松江地区汉族人群，且均知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 颈动脉彩色多普勒超声检测

采用荷兰飞利浦公司HD11型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率7.5MHz，两位超声科主治医师操作。患者取平卧位，头部偏向检查对侧45°，充分暴露颈部动脉，分别取横切面和长轴切面，测量指标为①颈总动脉(CCA)内径：于CCA分叉前1.0～2.0 cm处测量；②颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)内径：距分叉膨大部(BIF)以远1.0～2.0 cm处分别测量；③颈动脉内中膜厚度(IMT)：血管腔内膜界面的前缘至中膜-外膜界面前缘的垂直距离；④管腔狭窄程度：狭窄率=(正常血管管径-最窄处管径)/正常血管管径×100%。

判定标准[6-7]：根据颈动脉IMT厚度、有无斑块形成及颈动脉管径狭窄程度分成6级，即内膜正常为CCA、ICA的IMT<1.0 mm，内膜可不光滑，但无明显隆起斑块形成；Ⅰ级为CCA、ICA的1.0 mm≤IMT≤1.2 mm；Ⅱ级为颈动脉粥样硬化斑块形成，但是颈动脉狭窄率<50%；Ⅲ级为斑块增大，管腔狭窄率50%～70%；Ⅳ级为管腔狭窄率达70%以上，但未闭塞；Ⅴ级为管腔完全闭塞，无彩色血流及多普勒信号。根据以上颈动脉多普勒超声表现分组：将受试者颈动脉IMT<1.0 mm者设为内膜正常组，即对照组；Ⅰ～V级患者设为颈动脉粥样硬化，入颈动脉粥样硬化组。

排除标准：排除心源性脑栓塞、创伤、心肌梗死、肝肾疾病、自身免疫疾病、凝血异常、肿瘤。

1.2.2 PCR-RFLP检测及PCR扩增产物碱基序列测定

抽取肘静脉血2 mL，肝素钠抗凝管抗凝，采用基因提取试剂盒(美国OMEGA公司生产)提取DNA，于-80 ℃保存。

PCR扩增引物：上游引物5’-GTGTGGCTGGAATGGTGGCAGGAG-3’，下游引物5’-GAGGGTCCCACCTGAGCCAATGTG-3’。PCR反应体系：采用50 μL反应体系，模板DNA 15 μL，引物2 μL，2×PCR 反应混合物25 μL，双蒸水8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，65.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，72 ℃末次延伸10 min，反应管冷却至4 ℃。酶切体系：10×Buffer Bse Ⅺ 2 μL，内切酶BseⅪ 1 μL，PCR产物10 μL，最后加双蒸水至20 μL，65 ℃恒温孵育12 h，取10 μL酶切产物加6×DNA 标记染料 2 μL。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳45 min，0.1%嗅化乙锭染色，Bio-Rad凝胶成像系统检测电泳表现并照相。

对PCR扩增产物进行碱基序列测定，由上海基尔顿生物公司完成。

1.2.3 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件，计量资料比较采用成组t检验；计数资料比较用χ2检验，Hardy-Weinberg平衡用χ2检验。危险因素的筛选采用二分类Logistic回归。基因频率和基因型频率的差异用χ2检验或有关校正方法。以P<0.05示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组基本临床资料比较

2组在性别、年龄、体重指数、血糖、吸烟史、饮酒史等一般临床资料比较无显著性差异(P>0.05)；颈动脉粥样硬化组血压及脑血管病史比例高于对照组(P<0.05)，而高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白A(ApoA)水平低于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 颈动脉粥样硬化组和对照组基本临床资料比较

注：1 mmHg=0.133 Kpa

2.2 NAD(P)H氧化酶p22phox亚基-A930G基因PCR-RFLP

基因扩增产物通过限制性内切酶BseⅪ酶切后得到纯合子(AA)基因型为一条254 bp的片断； 杂合子(AG)基因型为3条不同长度的片段，分别为254 bp、197 bp和57 bp；纯合子(GG)基因型被切切为2条片段，长度分别为57 bp和197 bp(图1)。

2.3 DNA碱基序列检测

对PCR产物进行DNA碱基测序，基因测序与酶切相匹配(图2)。

图1 NAD(P)H氧化酶p22phox亚基-A930G基因PCR扩增产物电泳 M为Marker;1、3、4为AA基因型(254bp);2为AG基因型(254bp、197bp和57bp);5为GG基因型(197bp和57bp)

2.4 2组-A930G基因型频率及基因频率比较

颈动脉粥样硬化组和对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，本研究群体具有群体代表性。颈动脉粥样硬化-A930G基因AA、AG、GG型基因型频率与对照组比较有明显差异(P<0.05)。颈动脉粥样硬化组A、G等位基因的基因频率与对照组比较也有明显差异(P<0.05)(表2)。

表2 2组-A930G基因型频率及等位基因频率分布

注：与对照组比较，*P<0.05

2.5 -A930G基因各基因型之间基本临床资料比较

AA基因型HDL水平及ApoA水平较GG+AG基因型高(P<0.05)，GG+AG基因型吸烟比例较AA基因型高(P<0.05)，而其它临床资料无显著差异(P>0.05)(表3)。

表3 -A930G基因各基因型之间基本临床资料比较±s)

2.6 二分类logistic回归分析

吸烟、高血压病、HDL水平、G等位基因是颈动脉粥样硬化的独立危险因素(G等位基因：β=0.498，OR=1.785，P=0.031，95%CI=1.364～7.983)(表4)。

表4 颈动脉粥样硬化危险因素Logistic回归分析结果

图2 NAD(P)H氧化酶p22hox亚基-A930G基因测序 箭头显示处即为基因多态性位点,纯合子为多态性位点处出现单条测序峰,杂合子则出现两条测序峰;红色峰为T;绿色峰为A;黑色峰为G;蓝色峰为C

3 讨 论

NAD(P)H是心血管系统包括超氧阴离子(O2-)在内的ROS的主要来源。p22phox作为血管NAD(P)H氧化酶的亚单位，在维持氧化酶活性和合成ROS的过程中起关键作用[3]。p22phox由CYBA(cytochrome b245 alpha)基因编码，-A930G CYBA基因多态性(rs9932581)位于其启动子区，影响着CYBA基因的转录活性[8]。G等位基因的表达可引起p22phox亚基转录活性增高，产生过多的ROS，进而引起血管平滑肌细胞增殖、血管内皮功能障碍、脂质过氧化、加速动脉粥样硬化斑块的形成[9]。颈动脉粥样硬化是中老年人常见血管病变，且约60%的缺血性脑卒中患者伴有颈动脉粥样硬化。近年涉及NAD(P)H氧化酶p22phox亚基遗传变异性与颈动脉粥样硬化的关系研究国内外已有报道，但C242T基因多态性与颈动脉粥样硬化之间的相关性研究存在争议较大，可能与研究人群的地区及种族差异有关[10-11]，且-A930G与颈动脉粥样硬化之间的研究报道甚少。

血脂代谢异常是动脉粥样硬化斑块形成过程中的必要条件。血清ApoB水平反映了具有潜在致动脉粥样硬化功能的血脂如LDL、中等密度脂蛋白及VLDL的水平。相反，ApoA携载的是HDL颗粒，其血清水平则反映了具有血管保护作用的HDL颗粒水平，且与颈动脉粥样硬化斑块形成程度呈负相关[12]。研究发现被氧自由基介导氧化所形成的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)可导致动脉粥样硬化效应增强[13]，而HDL经氧化修饰形成氧化型高密度脂蛋白(ox-HDL)后其抗氧化、抗炎和调节胆固醇的能力将减弱，甚至消失，成为致动脉粥样硬化的脂蛋白[14]。我们前期的研究发现NAD(P)H氧化酶p22phox亚基基因多态性可以通过影响NAD(P)H氧化酶的活性，改变脉管系统的氧化还原状态而影响脂蛋白的氧化反应，促进动脉粥样硬化斑块的形成，与大动脉粥样硬化型缺血性脑卒中的发生相关[15]。

许多研究已证实，吸烟是动脉粥样硬化发生的危险因素之一，NADPH氧化酶在吸烟参与的氧化应激中具有促进作用。NAD(P)H氧化酶能被吸烟的烟雾中的一些可溶性物质激活[16]，使人和动物的血管内皮细胞产生大量的O2-[17]。有研究发现，在吸烟人群中NAD(P)H氧化酶p22phox亚基-A930G基因多态性与冠心病发病密切相关，G等位基因携带者冠心病的发生较AA基因型携带者显著升高[18]。Fan等[19]的研究发现在芬兰青年人群虽然只有13.7%的高血压病患者和0.9%的糖尿病患者，但吸烟的比例高达52.8%。有研究发现，吸烟者颈动脉平均和最大内膜中层厚度(Intima-media thickness,IMT) 较非吸烟者明显增厚，而且在吸烟人群中NAD(P)H氧化酶p22phox亚基-A930G基因GG纯合子基因型人群中颈动脉平均和最大IMT均较A等位基因携带者明显升高(GG vs.GA+AA,P=0.021和P=0.012)；相反，在非吸烟人群中G等位基因携带者颈动脉平均和最大IMT较AA基因型人群低(GG + GA vs.AA,P=0.015和P=0.018)。本研究也发现，G等位基因携带者吸烟比例较AA基因型高。Logistic回归显示，吸烟、G等位基因均可能是颈动脉粥样硬化发生的危险因素。

San等[8]的研究发现，原发性高血压病患者携带有GG基因型的个体NAD(P)H氧化酶亚基p22phox mRNA 和蛋白表达水平以及NAD(P)H氧化酶的活性均较AA+AG基因型携带者明显升高，而在非高血压病人群中GG基因型与AA+AG基因型的相比较无明显差异。在对13项NAD(P)H氧化酶p22phox亚基-A930G基因多态性与高血压病的相关性的meta分析中发现，-A930G基因多态性的GG+GA基因型频率和G等位基因频率均与高血压病密切相关[4]。G等位基因在欧洲人群中的频率是0.35，日本人群频率是0.477，本研究结果显示上海松江地区人群G等位基因频率是0.388。此外，在体外细胞实验中血管平滑肌细胞等位基因A被G取代后其基因表达水平较前提高了30%[8]。p22phox亚基-A930G基因的过度表达是NAD(P)H氧化酶活性增强的关键因素，NAD(P)H氧化酶活性的增加影响了血管内皮NO合酶解耦联，致使在高血压病患者血管内皮NO产物较正常血压者明显减少，导致血管内皮活性氧产生增加[20]。血管内皮ROS的产生诱导了血管壁的氧化应激，促进了血压的升高,血管平滑肌细胞的增殖，加速了动脉粥样硬化斑块的形成。本研究中颈动脉粥样硬化组血压水平较对照组明显升高。Logistic回归显示，高血压病和G等位基因同样是颈动脉粥样硬化发生的危险因素。

综上所述，上海松江地区汉族人群-A930G基因多态性可能与颈动脉粥样硬化有关。颈动脉粥样硬化组较对照组有更高的GG+AG基因型频率及G等位基因频率，且GG+AG基因型人群较AA基因型人群有更高的血压水平、吸烟比例以及更低的HDL、ApoA水平。Logistic回归分析显示，G等位基因可能与高血压病、吸烟以及HDL水平一样均是颈动脉粥样硬化的独立危险因素，G等位基因可能会增高颈动脉粥样硬化的发生风险，但确切机制尚不清楚。可能与-A930G基因多态位点位于CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPs)转录因子的结合位点上，上调了C/EBP的表达后增强了NAD(P)H氧化酶基因启动子G等位基因的转录活性有关[8]。有待进一步临床研究结合基础实验明确-A930G基因多态性在颈动脉粥样硬化发病中的作用。由于本研究样本量较小，可能存在选择性偏倚等，尚需扩大样本进一步证实研究结果的可靠性，为临床颈动脉粥样硬化及缺血性脑卒中的诊治提供依据。

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