解偶联蛋白2基因-866G/A,Ala55Val及Ins/Del多态性与宁夏回族人群脑缺血发病风险的相关性研究

金毅然 马斌武 孙文青 韩怀钦 何仲义 牛建国

目前脑缺血已成为临床常见多基因疾病，其发病率、致残率、病死率逐年提高。基因的单核苷酸多态性(SNPs)是形成个体间差异的重要遗传学基础。怎样从数百万SNP中找到确有临床意义的功能性SNP，是个体化医学所面临的重大挑战[1]。

功能性的SNP可能影响基因的表达水平及蛋白的活性，进而影响其在机体细胞内的功能[2]。解偶联蛋白2(uncouple protein 2，UCP2)参与调控细胞内过氧化物质(ROS)的生成，其基因多态性(图1)已经被众多研究者在不同人群中证实[3]。宁夏地区的回族人群中，脑缺血发病率在逐年升高。目前尚无UCP2基因多态性在回族人群中的分布资料。本研究以宁夏地区回族人群为研究对象，分析UCP2基因多态性在回族人群的分布特点及UCP2SNP与脑缺血发病风险的相关性。

图1 UCP2基因多态性分布位点示意图

1 对象与方法

1.1 研究对象

回族脑缺血患者诊断及正常对照组：脑缺血组71例，来自2014年1月-2015年10月在宁夏医科大学总医院就诊的宁夏地区回族住院患者，年龄50～65岁，均行颅脑CT和/或MRI检查证实脑缺血，诊断依据中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南；对照组97例，为同期门诊查体宁夏回族健康者，年龄50～65岁。所有研究对象均行生化项目检查并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本基因组DNA提取 采集外周血，经抗凝后采用QIANGEN minikit按试剂盒说明书进行基因组DNA提取，利用Nanodrop ND1000测定DNA浓度，用琼脂糖凝胶电泳判断DNA质量，筛选优质DNA做后续实验。

1.2.2 聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术 采用Oligo7.0软件设计引物。各位点引物序列为

UCP2-866G/A，上游引物 5’-CACGCTGCTTCTGCCAGG AC-3’；下游引物 5’-AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。

Ala55Val(Exon4)，上游引物 5’-CTCCTCTTGGCTTAGATTCCTG-3’；下游引物 5’-GACAGAATCATACAGGCCGAT-3’。

Ins/Del(Exon8)，上游引物 5’-TGCCCTCCTTTCTCCGCTTG-3’；下游引物 5’-ATGGACCAGATGACCTACACG-3’。

采用常规PCR扩增包含相应位点的DNA片段。经凝胶电鉴定扩增产物后经限制性内切酶消化，37 ℃ 4 h，将酶切产物电泳后采用Bio-Rad凝胶成像系统判断基因分型。

1.2.3 统计学处理

采用SPSS19.0分析软件，检验水准设定为双侧P<0.05。定量数据均以均数±标准差(±s)表示，2组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，变异位点的基因型和等位基因频率的组间差异分析采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组基本资料比较

正常对照组性别(男/女)比例为47/50，脑缺血组性别比例为37/34；正常对照组年龄(57.55±3.66)岁，脑缺血组年龄(58.68±3.86)岁；正常对照组体重(64.15±8.63)kg，脑缺血组体重(65.58±8.25)kg；2组在性别比例、年龄及体重等基础数据方面无明显差异(P>0.05)。脑缺血组血清甘油三酯含量(1.62±0.58) mmol/L高于正常对照组(1.62±0.58) mmol/L(P<0.05)，但2组血清总胆固醇水平无明显差异(P>0.05)(表1)。

表1 脑缺血组及正常对照组基本资料比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05

2.2 UCP2-866G/A在宁夏地区回族正常人群、脑缺血患者分布特点及其与回族人群脑缺血的相关性

在回族正常人群中UCP2-866位点基因型GG、AA、GA的分布频率分别为23.71%，24.74%，51.55%；在脑缺血患者中分布频率分别为30.98%，21.13%，47.89%。2组频率分布无明显差异(P>0.05)(表2)。

表2 回族正常人群及脑缺血患者UCP2-866G/A基因型分布特点[n(%)]

在回族正常人群中UCP2-866位点等位基因G、A的分布频率分别为49.48%，50.52%；在脑缺血患者中分布频率分别为54.93%，45.07%。2组等位基因型G、A的分布频率无明显差异(P>0.05)(表3)。

表3 回族正常人群及脑缺血患者UCP2-866G/A等位基因分布特点[n(%)]

2.3 UCP2Ala55Val在宁夏地区回族正常人群及脑缺血患者分布特点及其与回族人群脑缺血的相关性

在回族正常人群中UCP2Ala55Val基因型Ala/Ala、Ala/Val、Val/Val的分布频率分别为31.96%，49.48%，18.56%；在脑缺血患者中分布频率分别为32.39%，46.48%，21.13%。2组分布频率无明显差异(P>0.05)(表4)。

表4 回族正常人群及脑缺血患者UCP2Ala55Val基因型分布特点[n(%)]

在回族正常人群中UCP2Ala55Val等位基因C、T的分布频率分别为56.70%，43.30%；在脑缺血患者中分布频率分别为55.63%，44.37%。2组等位基因型C、T的分布频率无明显差异(P>0.05)(表5)。

表5 回族正常人群及脑缺血患者UCP2Ala55Val等位基因分布特点[n(%)]

2.4 UCP2Ins/Del在宁夏地区回族正常人群及脑缺血患者分布特点及其与回族人群脑缺血的相关性

在回族正常人群中UCP2Ins/Del位点基因型Del/Del、Ins/Del、Ins/Ins的分布频率分别为49.5%，41.2%，9.3%；在脑缺血患者中分布频率分别为47.9%，42.3%，9.8%。2组频率分布无明显差异(P>0.05)(表6)。

表6 回族正常人群及脑缺血患者UCP2Ins/Del基因型分布特点[n(%)]

在回族正常人群中UCP2Ins/Del等位基因Ins、Del的分布频率分别为70.10%，29.90%；在脑缺血患者中分布频率分别为69.01%，30.99%。2组等位基因型Ins、Del的分布频率无明显差异(P>0.05)(表7)。

表7 回族正常人群及脑缺血患者UCP2Ins/Del等位基因分布特点[n(%)]

3 讨 论

研究者们对于基因的各种功能以及基因与疾病的发生和治疗的关系等仍在进一步的探索中。人类的基因组序列存在个体差异，包括对疾病的易感性、对同一疾病治疗药物的反应性等。基因的单核苷酸多态性(SNPs)是形成个体间差异的重要遗传学基础，基于SNP分析的个体化医疗特点已经基本确立[4]。

UCP2是线粒体阴离子转运体蛋白家族中的一员，它存在于线粒体内膜上。研究证明，UCP2参与调控细胞内过氧化物质(ROS)的生成[5]。Negre-Salvayre等用GDP抑制多种组织线粒体中UCP2的质子转运活性，结果发现AMP 增高，线粒体内ROS的产生也明显增加[6]。基因敲除的小鼠胰岛细胞中的活性氧水平明显升高[7]。脑缺血后细胞内ROS产生增多或清除能力减弱导致神经细胞对缺血的易感性升高，将对机体产生严重损害。研究者证实，UCP2通过参与神经元线粒体氧化磷酸化过程来降低神经元ROS水平[3]。本课题组在以往研究中发现,脑缺血后小鼠海马神经元DNA过氧化损伤与UCP2基因表达水平相关[8]。

功能性的SNP可能影响基因的表达水平及蛋白的活性，进而影响其在机体细胞内的功能[9]。UCP2 基因的多态性已经被众多研究者在不同人群中证实。国内学者曾经分析了UCP2 基因的多态性在北京地区人群的分布特点[10]。UCP2-866G/A，UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del被证明在一些特定人群与糖尿病的发病风险密切相关[11]。以上3个位点的多态性直接影响UCP2基因表达水平及蛋白功能，影响细胞的能量代谢。虽然脑缺血的发病亦与机体细胞能量代谢水平紊乱相关，但是本研究结果表明UCP2-866G/A，UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del多态性与宁夏地区回族人群脑缺血发病无明显相关性。

本研究首次以宁夏地区回族人群为研究对象，分析了UCP2 基因多态性在回族人群的分布特点及UCP2 SNP与脑缺血发病风险的相关性，为我区临床防治回族人群脑缺血提供遗传学资料。

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