带状疱疹病人T淋巴细胞亚群凋亡与CD95表达的关系*

王 璐 任长和 赵姣妹 许 飏 欧册华△

（西南医科大学附属医院1疼痛科；2皮肤科，泸州646000）

带状疱疹(herpes zoster,HZ)多发生于老年人及免疫低下者，其产生的疼痛给病人带来巨大痛苦。然而，目前为止，带状疱疹治疗不够理想，归根结底是对其病理机制不够清楚。国内外相关研究显示，T淋巴细胞与HZ疾病的发生发展密切相关，带状疱疹病毒感染T淋巴细胞时，T淋巴细胞凋亡增高[1]，HZ病人体内T淋巴细胞免疫功能下降[2,3]。此外，CD95是外源性细胞凋亡途径的重要受体，介导了淋巴细胞的凋亡，CD95在一些病毒感染病人的淋巴细胞中表达增加，如梅毒、HIV等[4,5]。然而，CD95是否参与了HZ的发生，以及HZ病人T淋巴细胞亚群凋亡率与其表面CD95表达水平的关系仍不清楚。因此，本研究探讨了HZ病人外周血T淋巴细胞亚群CD4+T细胞、CD8+T细胞的凋亡情况，以及其细胞表面CD95抗原的表达情况，从而为更好了解及治疗HZ提供理论依据。

方 法

1.一般资料

收集本院疼痛科及皮肤科2017年6月10日至2017年9月30日住院的急性期HZ病人33例，包括男16例，女17例；年龄13 ～ 81岁，平均(58.67 ± 15.74)岁。按年龄分两组：中青年组（＜ 60 岁）16例，老年组（≥60岁）17例；按疼痛程度分3组：轻度疼痛组（2～4分）8例，中度疼痛组（5～7分）14例，重度疼痛组（＞ 7分）11例。同期收集健康对照者20例，其中男10例，女10例；年龄27～78岁，平均(59.00 ± 18.51)岁。两组性别和年龄比较无统计学差异(P＞ 0.05)。

纳入标准：所有临床症状和体征符合诊断标准（参照赵辨《临床皮肤病学》），且发病后未进行相应治疗。

排除标准：入院前接受相应治疗者；合并严重心肺等系统性疾病；系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病；恶性肿瘤者；应用免疫制剂者；其他部位感染者。

2.实验器材及试剂

流式细胞仪、红细胞裂解液(555899)、FITC Annexin V 凋亡试剂盒( 556547)、CD8- PECyTM(557746)、CD95- PE(555674)、CD4- Per-CP-CyTM5.5抗体(552838)，试剂均购置于美国BD公司。

3.病人基本信息

病人入院后，由疼痛科及皮肤科相关护理人员记录病人年龄、性别、疼痛程度。采用视觉模拟评分法(visual analogue scale,VAS) 评分标准：0～1分，无痛；2～4分，轻度疼痛，病人能忍受；5～7分，中度疼痛，病人疼痛并影响睡眠；8～10分，重度疼痛，病人疼痛剧烈难忍。

4.外周血检测指标

标本采集：病人入院次日清晨空腹抽取肘静脉血3 ml，用肝素抗凝，2 h内处理标本并进行检测。

检测方法：采用流式细胞术检测病人外周血T淋巴细胞亚群CD4+T细胞、CD8+T细胞凋亡率及其细胞表面CD95的表达。

T淋巴细胞亚群凋亡率检测：取100 μl抗凝全血，加入 CD4抗体 20 μl、CD8抗体 5 μl，混匀，室温避光孵育15 min。加入1×红细胞裂解液2 ml，混匀，室温避光裂解15 min，离心(1 000 r/min,5 min)，弃上清。加入1× binding buffer 2 ml，离心(1 000 r/min,5 min)，弃上清。加入Annexin-V FITC、PI试剂各5 μl，避光孵育15 min。加入 500 μl PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测凋亡。

T淋巴细胞表面CD95抗原表达水平检测：取100 μl抗凝全血，加入 CD95抗体 20 μl、CD4抗体20 μl、CD8 抗体 5 μl，混匀，室温避光孵育 15 min。加入1 × 红细胞裂解液2 ml，混匀，室温避光裂解15 min，离心(1 000 r/min,5 min)，弃上清。加入500 μl PBS重悬细胞，上流式细胞仪分析。

5.统计学处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行分析。数据以均数±标准差(x±SD)表示，不同疼痛程度组之间的比较采用方差分析，其他的组间比较采用t检验，T淋巴细胞凋亡率与CD95表达的相关性采用Pearson相关分析，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.HZ组和对照组外周血T淋巴细胞亚群凋亡率

结果显示正常对照组CD4+T细胞和CD8+T细胞仅有少许凋亡。HZ病人CD4+T细胞凋亡率显著高于正常对照组(P＜ 0.05)，CD8+T细胞凋亡率显著高于正常对照组（P＜ 0.05，见图1）。

2.T淋巴细胞亚群表面CD95抗原的表达水平

HZ病人CD4+T细胞表面CD95的表达高于正常对照组(P＜ 0.05)，CD8+T细胞表面CD95的表达高于正常对照组（P＜ 0.05，见图2）。

3.T淋巴细胞亚群凋亡率与CD95表达的相关性分析

HZ病人CD4+T细胞凋亡率与其表面CD95表 达 呈 正 相 关 (r= 0.75,P＜ 0.05)。HZ 病 人CD8+T细胞凋亡率与其表面CD95表达呈正相关（r= 0.53,P＜ 0.05，见图 3）。

4.HZ病人不同年龄组T淋巴细胞亚群凋亡率及CD95的表达水平

≥60岁组病人外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞凋亡率都显著高于＜ 60岁组病人(P＜ 0.05)，≥60岁组病人CD4+T细胞及CD8+T细胞表面CD95的表达水平均高于＜ 60岁组病人（P＜ 0.05，见图4）。

5.HZ病人不同疼痛程度组T淋巴细胞亚群凋亡率及CD95的表达水平

不同疼痛程度组的T淋巴细胞亚群凋亡率及CD95的表达水平差异无统计学意义（P＞ 0.05，见图5）。

6.HZ病人不同性别组T淋巴细胞亚群凋亡率及CD95的表达水平

HZ病人外周血T淋巴细胞亚群的凋亡率及CD95的表达水平在男性和女性两组间的差异无统计学意义（P＞ 0.05，见图6）。

图1 正常对照组与HZ病人外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞凋亡情况(%)(A-C)：CD4+T细胞凋亡情况；(D-F)：CD8+T细胞凋亡情况*P ＜ 0.05，与正常对照组比较Fig.1 The apoptosis level of CD4+T lymphocyte and CD8+T lymphocyte in peripheral blood from control and HZ patients (%)(A-C): the apoptosis level of CD4+T lymphocyte; (D-F): the apoptosis level of CD8+T lymphocyte.*P ＜ 0.05,compared with normal Control group.

图2 正常对照组与HZ病人外周血CD4+、CD8+T细胞表面CD95的表达情况(%)(A-C)：CD4+T细胞表面CD95的表达情况；(D-F)：CD8+T细胞表面CD95的表达情况*P ＜ 0.05，与正常对照组比较Fig.2 The expression of CD95 antigen on the surface of CD4+T lymphocyte and CD8+T lymphocyte in peripheral blood from control group and HZ group (%)(A-C): the expression of CD95 on the CD4+T lymphocyte surface; (D-F): the expression of CD95 on the CD8+ T lymphocyte surface*P ＜ 0.05,compared with normal Control group.

图3 HZ病人T淋巴细胞凋亡率与CD95表达的相关性(A)： CD4+ T细胞凋亡率与其表面CD95表达相关性；(B)：CD8+ T细胞凋亡率与其表面CD95表达相关性Fig.3 Correlation between the apoptosis rate of T lymphocyte and the expression of CD95 in HZ patients(A): correlation between the apoptosis rate of CD4+T lymphocyte and the expression of CD95; (B): correlation between the apoptosis rate of CD8+ T lymphocyte and the expression of CD95.

图4 HZ病人不同年龄组T淋巴细胞凋亡率及CD95的表达水平(A)：CD4+T细胞凋亡情况；(B)：CD8+T细胞凋亡情况；(C)：CD4+T细胞表面CD95的表达情况；(D)：CD8+ T细胞表面CD95的表达情况*P ＜ 0.05，与＜ 60岁组病人比较Fig.4 The apoptosis level of T lymphocyte and the expression level of CD95 on T lymphocyte surface at different age in HZ patients(A): the apoptosis level of CD4+T lymphocyte; (B): the apoptosis level of CD8+T lymphocyte; (C): the expression of CD95 on the CD4+T lymphocyte surface; (D): the expression of CD95 on the CD8+T lymphocyte surface*P ＜ 0.05,compared with middle-aged group (＜ 60 years).

讨 论

带状疱疹病毒是一种α疱疹病毒，它在体内的再次激活导致HZ的发生[6]。相关研究证实HZ的发生发展与机体免疫反应密切相关，对带状疱疹病毒感染的控制是通过T细胞介导的细胞免疫而不是B细胞介导的体液免疫[7,8]。动物模型表明B细胞的缺失并不能改变疾病的严重程度，而在带状疱疹病毒接种过程中，CD4+T细胞及CD8+T细胞的耗竭会导致病毒载量增高[9]。由此可见，CD4+T细胞和CD8+T细胞在带状疱疹病毒感染过程中发挥重要作用。

细胞凋亡与病毒感染、免疫性疾病等密切相关，包括内源性和外源性凋亡途径，是细胞数量减少的一个非常重要的起始程序，它可通过调节机体T淋巴细胞各亚群的数量，从而影响机体的免疫强度。本研究结果显示，HZ病人外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞凋亡率明显高于健康对照组(P＜ 0.05)，提示T淋巴细胞的凋亡与HZ的发生密切相关，这与Konig等[1]在感染VZV后T淋巴细胞凋亡率增高的研究结果一致。早期的国内外研究中只报道了HZ病人外周血T淋巴细胞亚群数量发生变化，而CD95在HZ病程中的作用却未见报道，我们此次的研究重点分析CD95是否通过外源性凋亡途径调节T淋巴细胞的凋亡而参与HZ病程。

CD95是I 型跨膜蛋白，是细胞膜表面蛋白TNF/NGF-R家族的成员，表达于胸腺细胞、激活的淋巴细胞，与配体CD95L结合后可诱导凋亡，又称为“死亡蛋白”，具有调控T淋巴细胞内稳态和细胞毒性的重要功能[10,11]。在本次研究中，我们对外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞表面的CD95抗原水平进行检测，结果表明HZ病人外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞表面的CD95抗原表达水平明显高于健康对照组(P＜ 0.05)，且CD4+T细胞表面的CD95表达水平与CD4+T细胞凋亡率呈正相关(r= 0.76,P＜ 0.05)，CD8+T细胞表面的CD95表达水平与CD8+T细胞凋亡率呈正相关(r= 0.53,P＜ 0.05)，提示CD95死亡信号通路是介导HZ病人CD4+T细胞及CD8+T细胞凋亡的重要途径，与HZ的发生发展密切相关。

图5 HZ病人不同疼痛程度组T淋巴细胞凋亡率及CD95的表达水平(A)：CD4+T细胞凋亡情况；(B)：CD8+T细胞凋亡情况；(C)：CD4+T细胞表面CD95的表达情况；(D)：CD8+T细胞表面CD95的表达情况Fig.5 The apoptosis level of T lymphocyte and the expression level of CD95 on T lymphocyte surface at different degree of pain in HZ patients(A): the apoptosis level of CD4+T lymphocyte; (B): the apoptosis level of CD8+T lymphocyte; (C): the expression of CD95 on the CD4+T lymphocyte surface; (D): the expression of CD95 on the CD8+T lymphocyte surface.

图6 HZ病人不同性别组T淋巴细胞凋亡率及CD95的表达水平(A)：CD4+T细胞凋亡情况；(B)：CD8+T细胞凋亡情况；(C)：CD4+T细胞表面CD95的表达情况；(D)：CD8+T细胞表面CD95的表达情况Fig.6 The apoptosis level of T lymphocyte and the expression level of CD95 on T lymphocyte surface at different gender in HZ patients(A): the apoptosis level of CD4+T lymphocyte; (B): the apoptosis level of CD8+T lymphocyte; (C): the expression of CD95 on the CD4+T lymphocyte surface; (D): the expression of CD95 on the CD8+T lymphocyte surface.

最后，相关研究显示年龄和疼痛是发生带状疱疹后神经痛（postherpetic neuralgia,PHN）的独立风险因素[12～14]。而对于HZ病人而言，这些风险因素与机体内T淋巴细胞的凋亡情况，以及与T淋巴细胞表面CD95抗原水平的关系是不清楚的。在本研究中，我们发现老年病人（≥60岁）外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞的凋亡率及其表面CD95抗原的表达水平与中青年病人（＜ 60岁）相比显著增高(P＜ 0.05)，不同性别组、不同疼痛程度组的CD4+T细胞、CD8+T细胞凋亡率及CD95表达水平差异无统计学意义(P＞ 0.05)，提示T淋巴细胞凋亡水平及CD95表达水平与病人性别及疼痛程度无明显相关性，而与年龄密切相关。即年龄越大，HZ病人T淋巴细胞的凋亡水平及其表面的CD95抗原表达水平则越高，使机体免疫力越低，而年龄又是发生PHN的危险因素，所以CD95介导的T淋巴细胞凋亡增加可能是老年病人更易发生PHN的机制之一。

综上所述，本次研究中，我们发现HZ病人外周血T淋巴细胞亚群CD4+T细胞及CD8+T细胞凋亡率增加，其细胞表面CD95抗原的表达也增加，且CD95抗原的表达水平与T淋巴细胞的凋亡率呈正相关。因此，我们推测CD95信号通路介导的T淋巴细胞凋亡参与了HZ的发生。但本次研究只对急性期HZ病人做了检测分析，具有一定的局限性，而发生PHN的机制复杂，影响因素多，有关CD95介导的T淋巴细胞凋亡与PHN的关系有待进一步研究。

参 考 文 献

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