一株肠源唾液乳杆菌的分离鉴定及生物学特性

许守涛，刘?，储卫华

（中国药科大学生命科学与技术学院微生物学系，江苏南京210009）

抗生素在疾病防控方面起了积极的作用，但由于抗生素的滥用，导致耐药细菌甚至超级细菌的出现，因此寻找抗生素的替代品成为科研人员的关注热点。随着最近几年对肠道菌群在疾病发生过程中的作用的认识，益生菌作为一种抗疾病的替代品越来越受到人们的重视，益生菌是一种通过改善肠道菌群平衡，有益于宿主动物的活微生物添加剂［1］。益生菌通过调节黏膜和全身免疫功能以及改善肠道微生物营养平衡对宿主产生有益影响［2－3］。肠道内有许多种类的微生物，其总数在1013～1014个之间，乳酸菌（lactic acid bacterial，LAB）是肠道菌群中的一类主要菌群，被认为是GRAS（generally recognized as safe）类细菌，可作为有益菌开发的出发菌株，乳酸菌在促进人和动物健康，减少抗生素使用等方面越来越受到重视。乳酸菌具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗应激以及抗心血管相关疾病的作用［4－5］，因此从肠道中分离具有抗菌活性，并能抵抗胃酸、肠液的消化，能到达肠管的乳酸菌是益生菌开发的前提。本试验旨在从健康成人粪便中分离出生物学特性优良的乳酸菌，从而为其作为益生菌研究、开发和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株分离及表型、生化鉴定

本试验于2016年3月开始在中国药科大学生命科学与技术学院微生物学实验室进行。取约0.1 g健康成人的粪便样品至10 mLMRS液体培养基中，将样品进行梯度稀释，并用旋转振荡器将样品振荡均匀；无菌吸取适宜梯度（10－4、10－5、10－6）的样品稀释液 100μL涂布于含 CaCO3的改良MRS固体琼脂平板上［6］，37℃倒置培养24～48 h后观察结果。挑取MRS平板上生长速度快、具有明显溶钙圈的菌落；转移到新的MRS平板，直至纯化。挑取单菌落进行革兰氏染色，并用乳酸菌生理生化微量发酵管进行生理生化反应试验，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行初步鉴定。

1.2 16S rDNA的扩增与序列分析

采用细菌基因组 DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）提取总DNA。以总DNA为模板，采用通用引物27F和1492R对CPU9601进行16S rDNA序列扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后送至南京金斯瑞生物公司测序。测序结果采用NCBI上的Blast比对与GenBank核酸数据库中的序列进行同源性比较，利用MEGA 5.0软件，邻位连接法（Neighbor－Joining，NJ）构建系统发育树［7］。

1.3 菌株生长特性的研究

将分离的唾液乳杆菌CPU9601的24 h培养物以1%的接种量接种到MRS培养基中，37℃静置培养测定生长曲线，并测定菌液pH值。以培养时间为横坐标，菌液吸光度和pH值为纵坐标，绘制生长曲线和pH值变化曲线。

1.4 酸、胆盐耐受试验

将菌株CPU9601接种到MRS培养基中，37℃培养24 h后；以1%的接种量分别接种于10 mL用1 mol／L的盐酸调节pH值分别至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5的 MRS液体培养基中，于37℃培养12 h后，测定600 nm处D值，3次重复。以1%的接种量分别接种于10 mL含0%、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%质量浓度胆盐的MRS液体培养基中，以不加胆盐的MRS液体培养基为对照，37℃培养12 h后，测定620 nm处 D值［8］，3次重复。

1.5 人工模拟胃肠液耐受试验

人工模拟胃肠液需新鲜配制［9］。将胃蛋白酶溶于pH值为2.5的PBS中使其终浓度为3 g／L，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟胃液。将胰蛋白酶溶于pH值为8.0的PBS中使其终浓度为1 g／L，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟肠液。将CPU9601过夜培养后4℃5 000 r／min离心15 min收集菌体，用无菌PBS（pH值为7.2）洗涤2次，将菌体重悬于10 mL pH值为2.5的人工胃液中并将其菌液密度调节为1×108CFU／mL；混匀后37℃ 200 r／min摇床振荡培养3 h，分别于0、1、2、3 h计活菌数。在模拟胃液中培养3 h后，取1 mL培养液加入至9 mL，pH值为8.0的人工肠液中，混匀后于37℃ 200 r／min摇床振荡培养6 h；分别于0、2、4、6 h后检测活菌数。用MRS固体培养基37℃培养48 h后计数。存活率计算公式：存活率＝N1／N0］。其中N1表示经过模拟胃、肠液处理之后的乳酸菌活菌数；N0表示未处理前乳酸菌的活菌数。

表1 菌株CPU9601的生理生化特性

1.6 药敏实验

采用K－B法对菌株CPU9601进行药敏试验。将CPU9601接种至MRS液体培养基中，接种量为1%，37℃培养24 h，菌悬液浓度调整为108CFU／ml并涂布在MRS固体平板表面；之后将标准药物纸片贴于平板表面，置37℃下培养24 h后测量并记录抑菌圈直径［10］。

1.7 抑菌试验

菌株CPU9601在MRS液体培养基中37℃培养24 h后；通过10 000 r／min离心10 min；然后将上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，获得无细胞上清液（cell－free solution，CFS）；采用牛津杯法测定乳酸菌经发酵得到的无细胞上清液的抑菌能力。选用大肠杆菌 ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌ATCC32664和铜绿假单胞菌PAO1为指示菌。将上述指示菌菌液吸取50μL均匀涂布于LB培养基固体平板，培养18 h后测量抑菌圈直径。

1.8 数据分析

所有数据均以平均值±标准差±s）表示。所得数据采用SPSS 17的单因素方差分析进行检验。将数据结果用Graphpad Prism 5.0绘图软件绘制趋势图。

2 结果

2.1 菌株分离及鉴定结果

从样本中分离得到40株分离菌，其中5株分离菌株为乳酸菌；可形成钙溶圈、革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性和无芽孢形成，在MRS平板上可以生长良好并形成乳白色的小菌落。根据抗菌活性筛选结果，挑取1株抗菌活性较强菌株，命名为CPU9601，进行生物学特性研究。CPU9601经过24 h培养后在MRS平板上形成较小圆形凸起菌落，呈乳白色，表面光滑湿润，不透明，边缘整齐，直径为（2.0±1）mm（图1）。该菌株的特征和乳酸菌一致，是一种兼性厌氧菌，其运动性、过氧化氢酶活性、明胶液化、淀粉水解、枸橼酸盐、硫化氢、吲哚、V－P、葡萄糖产气、尿素、D－核糖和七叶苷反应均为阴性；石蕊牛乳产酸、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和甘露醇反应均为阳性（表1）。

2.2 菌株CPU9601的16S rDNA扩增与序列分析

对菌株CPU9601进行16S rDNA基因PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其长度约为1 500 bp。经测序得到长度为1 432 bp的序列，提交至 GenBank，收录号为MG017448。对CPU9601的16S rDNA序列进行同源性比较，发现该菌株属于乳杆菌属，与Lactobacillus salivarius ATCC 11741（AF089108）的序列同源性达到99%（图2），结合生理生化鉴定结果，将菌株鉴定为唾液乳杆菌。

2.3 菌株CPU9601生长特性的研究

菌株CPU9601大约在2 h后进入对数生长期，8 h后进入稳定生长期。随着细菌的生长，其菌液的pH值也明显下降，在菌株进入对数生长期时菌液的酸度迅速降低，在稳定期后期 pH值维持在 3.5～4.0（图3）。

2.4 菌株CPU9601耐酸和胆盐耐受试验

胃液里含有大量的胃酸，能顺利通过胃液到达肠道定殖是益生菌的关键特性。试验发现，在较低的pH值（2.0～30）环境，CPU9601的生长被抑制，明显低于对照组（pH值为6.5）。胆汁耐受性是菌株在消化道中生长和生存的重要条件。在这个试验中，与对照组相比（0%），当胆汁浓度为2%时的D620nm值小于1。该菌株能耐受胆汁，但高浓度胆汁可抑制菌株生长（图4）。

2.5 菌株CPU9601在人工模拟胃肠液中的生长测定

对菌株CPU9601在人工胃液和人工肠液中的存活试验发现，随着时间的增加，菌株CPU9601的活菌数有所减少，但存活率可保持在85%以上（表2），说明唾液乳杆菌CPU9601可在GIT试验条件下存活。

2.6 菌株CPU9601药敏试验结果

通过K－B法药敏试验发现，菌株CPU9601对于临床常用抗生素敏感，但对头孢他啶、环丙沙星、苯唑西林、大观霉素4种抗生素具有抗性，对呋喃妥因、左氧氟沙星、头孢吡肟和头孢曲松中等敏感。

表2 菌株CPU9601在人工胃肠液中的存活率

2.7 菌株CPU9601上清液抑菌试验

菌株CPU9601上清液对大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC32664、金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿假单胞菌PAO1均具有抑制作用，其抑菌圈直径分别为（13.45±0.08）、（11.25±0.13）、（12.44±0.44）、（14.23±0.10）mm。

3 讨论

随着人们对肠道菌群在疾病中作用的不断认识，通过益生菌来改善疾病促进健康成为研究重点。目前，益生菌的出发菌株主要有乳酸菌、芽孢菌以及酵母菌，其中乳酸菌是最为广泛和认可的益生菌。益生菌能否到达肠道内，并在肠道内定殖、生长主要由低酸度环境和胆汁酸盐的浓度决定。本研究从健康成人的粪便中分离得到1株具有抗菌活性并能耐酸、耐胆盐的唾液乳杆菌。菌株CPU9601在pH值为2～3时其生长受到抑制，但仍然具有活菌存在；在pH值为4～6.5时生长不受限制，保持良好的生长性能；菌株CPU9601在胆盐浓度0.1%时生长不受影响，但当胆盐浓度达到0.3%、0.5%、1.0%、2.0%时，虽然能够生长，但菌含量明显低于对照组。董晓丽等分离的1株植物乳杆菌GF103也表现为在低pH值的情况下生长受到抑制，该菌株在0.15%、0.3%的胆盐浓度下生长良好［11］。本研究所分离的菌株CPU9601发酵上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌均有一定的抑制作用，这对感染性疾病的控制将是一个有效的途径。乳酸菌的抗菌活性主要是其生长过程中的代谢物，如过氧化氢、乙酸、乳酸和乳酸菌素都能抑制多种病原体，菌株CPU9601的抑菌功能是何种代谢产物发挥作用有待进一步研究。杨婧等从四川泡菜里分离了10株具有抗菌活性的乳酸菌，经过酸中和后，仅有1株菌对细菌和酵母菌仍具有抑菌活性，说明该菌株的抗菌活性可能是除乳酸以外的代谢产物［12］。

本研究所分离的CPU9601对常见的病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌均具有明显的抑制作用。通过生理生化试验和16S rRNA基因序列分析鉴定该菌株属于唾液乳杆菌。体外评价发现该菌株具有较好耐酸、耐胆盐的特性，能在人工胃液和肠液中存活，说明其能适应动物胃和肠道内环境。如何确定其生产实践中的应用效果，还有待进一步的研究及生产检验。

参考文献：

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