中华补血草内生真菌发酵物的抑菌和抗氧化活性

毛 涵，陈 婧，代 飞，汤新慧，薛 菲

（1.江苏省盐土生物资源研究重点实验室，江苏盐城224051；2.南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211816）

中华补血草［Limonium sinense（Girard）Kuntze］是白花丹科补血草属植物，别称匙叶草、盐云草、海菠菜、海赤芍等，为多年生泌盐草本植物，喜生于盐渍化的低洼湿地上，广泛分布于我国东北、华北、华东等地区［1］。现有研究发现，中华补血草具有刺激动物造血及补血、止血功能，其提取物具有调节免疫、保肝、抑制肿瘤、抗氧化、抑菌等多种药理活性，具有较高的药用价值［2］。近年来，国内外关于中华补血草的研究主要集中在其活性成分药用价值等方面，对其内生菌筛选的研究较少［3－5］。

植物内生菌泛指一切生活在植物体内而不使植物组织显示出明显感染症状的腐生、寄生、共生真菌及细菌等微生物［6－7］。内生菌主要包括内生真菌、内生细菌、内生放线菌。研究发现，内生真菌普遍存在于目前已研究过的各种药用植物中，在长期与药用植物共生的过程中，它对药用植物产生各种作用和影响，包括促进宿主植物生长发育、增强宿主植物的抗逆性、促进药用植物次生代谢产物的合成等作用［8－9］。

因此，利用药用植物内生真菌发酵生产生物活性物质，可以克服传统的从植物中分离纯化天然活性成分存在的周期长、受地域及其他条件限制等不足，为天然药用活性物质的获取开辟了新途径。但目前，运用植物内生真菌发酵得到次级代谢产物的含量还较低，尚不能满足工业化生产的要求，须要进一步探索和研究［10］。

本试验以江苏省盐城市滩涂丹顶鹤自然保护区采到的野生中华补血草为材料，分离筛选其内生真菌，鉴定并研究其抗氧化和抑菌能力，以期为筛选出具有产生药用价值代谢产物能力的菌种，及有效开发利用和保护本地区的中华补血草内生菌资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中华补血草，于2017年3月11日采集于江苏省盐城市大丰滩涂。

大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus lutea）、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），均购自中国菌种保藏中心。

L－抗坏血酸（维生素C）、水杨酸、次氯酸钠、氢氧化钠、二甲基亚砜、硫酸亚铁、浓盐酸、甲醇、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris－base）等均为分析纯，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）、硫酸链霉素，均购自南京奥多福尼生物科技有限公司；察氏培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；琼脂，购自上海伊卡生物技术有限公司；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐（MTT）试剂盒、96孔细胞培养板，均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器、电热恒温培养箱，均购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；TGL－16gR高速冷冻离心机，购自上海安亭科学仪器厂；EL204电子分析天平，购自梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；超净工作台、JJ－2组织捣碎机、PHS－3C精密酸度计，均购自上海康华生化仪器制造有限公司；HH－6数显恒温水浴锅，购自江苏省金坛市三和仪器有限公司；DHG－9023A液晶鼓风干燥箱，购自江苏省太仓市华利达实验设备有限公司；WFJ2000可见分光光度计，购自尤尼柯（上海）仪器有限公司；DYY－12型电泳仪，购自上海京工实业有限公司；PCR仪，购自上海赛默生物科技发展有限公司；IKE RV 10旋转蒸发仪，购自郑州长城科工贸易有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 中华补血草的表面消毒 按照以下步骤对中华补血草的根和叶片进行表面消毒处理：无菌水冲洗植物表面，洗净表面的泥土和灰尘，用5%次氯酸钠浸泡5 min消毒，用25%硫代硫酸钠浸泡10 min去除次氯酸钠，无菌水浸泡5 min，70%乙醇消毒5 min，用无菌水清洗5～6遍，最后1遍无菌水进行表面涂布，检验植物表面是否消毒彻底［11］。

1.3.2 内生真菌的分离纯化及保存 在无菌超净工作台上，把表面消毒后的根和叶片边缘切去少许，以形成新的伤口，叶片剪成约5 mm×5 mm小块，置于察氏固体培养基中，每个培养皿放入约3～4片，28℃倒置培养。每12 h观察1次。待根和叶片切口处长出菌丝后，采用菌丝尖端挑取法，根据菌落形成时间、菌丝形态及颜色的差异，挑取少许菌落边缘的菌丝，转接到新鲜的察氏培养基上培养数日，并观察记录各菌落的形态特征。反复纯化后，将菌株转至察氏固体培养基斜面上，28℃培养3～5 d后，4℃冰箱保存［12－13］。

1.3.3 内生真菌的发酵物的制备 从纯化的菌株中挑取少量菌丝于察氏培养基中，28℃，160 r／min振荡培养3～5 d。用4层无菌纱布过滤除去菌体，用乙酸乙酯萃取5～8次后用旋转蒸发仪浓缩，待大部分乙酸乙酯挥发后倒入小烧杯中，置于50℃水浴锅蒸发浓缩至浸膏状，得到各菌株的发酵产物。用30%二甲基亚砜分别稀释各菌株的发酵产物至1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25μg／mL待用［14－15］。

1.3.4 发酵物抗氧化能力的检测 分别采用DPPH自由基清除试验、羟基自由基清除试验来检测发酵物的抗氧化活性［16－18］。

1.3.5 发酵物抑菌能力的检测 以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌等5种菌为指示菌，利用牛津杯法［19］测定所筛菌株的抑菌活性；设定1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25μg／mL等 6个浓度梯度，利用MTT法［20］进一步研究其抑菌能力与浓度的关系。以上试验均做3次重复。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

采用组织切块法从中华补血草的根和叶片中筛选出其内生真菌，第3天发现培养基中组织块切口处有菌落长出，其中有些真菌的生长速度相对较快，菌丝很快附着组织块周围，随后对切口处的菌丝体进行多次分离和纯化。由表1可知，最终在中华补血草中共得到11株内生真菌，其中5株来源于叶片，6株来源于根部。将分离获得的菌株用无菌牙签挑取少许菌丝到固体培养基上，每个培养皿中1～3处，培养5 d后观察其生长情况和菌落特征，测量菌落直径，具体情况如表1所示。

表1 中华补血草内生真菌的菌落形态特征

2.2 抗氧化试验结果

2.2.1 DPPH自由基清除试验结果 以维生素C作为对照，对筛选出的11株中华补血草内生真菌的发酵物进行清除DPPH自由基的抗氧化活性研究，发现菌株A－1－5、A－2－5、A－2－13等具有清除DPPH自由基的能力。由图1可知，在不同的发酵物浓度下，3株菌株对DPPH自由基的清除能力表现为A－2－13＞A－2－5＞A－1－5，其中A－2－13表现优异，其发酵物对 DPPH清除率在 1 000.00、500.00、250.00、125.00μg／mL浓度下均超过 90%，与对照物维生素C的清除率接近，在 62.50、31.25μg／mL浓度下清除率分别达到65.4%、60.3%。菌株 A－2－5发酵物的清除率在1 000.00μg／mL时达到 73.73%，500.00μg／mL时达到5238%，25000、125.00μg／mL浓度下的清除率相当，分别为 3347%、34.56%，62.50、31.25μg／mL浓度下的清除率相当，分别为18.76%、16.78%。菌株A－1－5的清除率相对较小，其发酵物的浓度为1 000.00μg／mL时清除率最高，为41.07%，其发酵物的浓度为250.00μg／mL时清除率最低，为8.51%。

2.2.2 羟基自由基清除试验 以维生素C作为对照，对分离筛选出的11株真菌的发酵物进行羟基自由基清除试验，发现菌株A－1－8、A－2－5、A－2－8等具有清除羟基自由基的能力。由图2可知，菌株 A－1－8、A－2－5、A－2－8的发酵物对羟基自由基清除能力均随发酵物浓度的减小而下降。其中，菌株A－2－5表现出相对较高的羟基自由基清除能力，在 1 000.00、500.00、250.00、125.00μg／mL浓度下的清除率均高于90%，接近于对照物维生素C的清除率，在62.50μg／mL浓度下的清除率为75.5%，在31.25μg／mL浓度下的清除率为 35.72%；菌株 A－2－8的发酵物在1 000.00μg／mL浓度下的清除率最高，为 49.25%，在50000、250.00μg／mL浓度下的清除率分别为 38.79%、3601%，在 125.00μg／mL浓度下的清除率为 18.6%，在6250、31.25μg／mL浓度下没有清除能力；菌株 A－1－8发酵物的清除能力相对较弱，在1 000.00μg／mL浓度下的清除率最高，为29.93%，在31.25μg／mL浓度下的清除率最低，仅为6.91%。

2.3 抑菌试验结果

2.3.1 牛津杯法 本试验对分离出来的11株真菌的发酵物进行抑菌活性研究，发现菌株A－1－5、A－1－8、A－1－16、A－2－3、A－2－5、A－2－7、A－2－8、A－2－13等8株菌株具有抑菌活性。由表2可知，8株内生真菌的发酵物对指示菌的抑菌效果良好，其中，菌株A－1－8、A－1－16、A－2－3、A－2－7、A－2－8等5株菌对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用，菌株A－1－5、A－2－5、A－2－13等3株菌对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌均有抑制作用。相对而言，菌株 A－1－5、A－1－16、A－2－5、A－2－7、A－2－13等5株菌的抑菌作用较好，对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均为15～20 mm，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均大于25 mm。

2.3.2 MTT法 根据表2的研究结果选取抑菌活性较强的A－1－5、A－1－16、A－2－5、A－2－7、A－2－13等5株菌株做进一步研究，定量计算不同浓度梯度的发酵产物对上述5种指示菌的抑菌率大小及不同菌株发酵产物的最小抑菌浓度。

表2 8株中华补血草内生真菌对5种指示菌的抑菌活性测试结果

2.3.2.1 菌株A－1－5的发酵物对指示菌的抑菌试验结果由图3可知，在试验浓度范围内，菌株A－1－5的发酵物对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌等5种指示菌均有一定的抑制作用。其中，对枯草芽孢杆菌的抑菌作用最突出，在1 000.00、250.00μg／mL浓度下，抑菌率分别达到92.15%、96.55%；对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率随发酵物浓度的降低而下降，抑菌率最高值分别为1 000.00μg／mL浓度下对应的4955%、34.83%、49.61%；对藤黄微球菌的抑制作用最弱，在1 000.00μg／mL浓度下，抑菌率仅为5.51%。在最低发酵物浓度下，抑菌率均较低，对大肠杆菌和乙型副伤寒沙门菌的抑菌率分别为12.34%、13.08%，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的抑菌率分别为 1.92%、2.70%、1.79%。

2.3.2.2 菌株A－1－16的发酵物对指示菌的抑菌试验结果 由图4可知，在试验浓度范围内，菌株A－1－16的发酵物对藤黄微球菌的抑制作用极弱，在1 000.00μg／mL浓度下，抑菌率仅为0.35%，对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等4种指示菌的抑菌率随发酵物浓度的降低而下降。其中，对枯草芽孢杆菌的抑制作用突出，在不同发酵物浓度下其抑菌率均明显高于其他指示菌。在1 00000μg／mL时，菌株A－1－16的发酵物对枯草芽孢杆菌的抑菌率为95.38%，而对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为 47.74%、45.40%、5417%；在 31.25μg／mL时，菌株 A－1－16的发酵物对枯草芽孢杆菌的抑菌率为23.12%，对另3种指示菌的抑菌率均低于10%。

2.3.2.3 菌株A－2－5的发酵物对指示菌的抑菌试验结果由图5可知，菌株A－2－5的发酵物对5种指标菌的抑菌率均随发酵物浓度的降低而下降。其中，对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，在1 000.00μg／mL浓度下的抑菌率最高，为93.97%，在 31.25μg／mL浓度下的抑菌率最低，为 16.81%；对大肠杆菌和乙型副伤寒沙门菌在31.25μg／mL浓度下没有抑制作用，在1 000.00μg／mL浓度下的抑菌率最高，分别为5679%、50.22%，在62.50μg／mL浓度下的抑菌率最低，分别为1513%、6.57%；对金黄色葡萄球菌，当发酵物浓度低于250.00μg／mL时没有抑菌活性，在 1 000.00μg／mL浓度下的抑菌率最高，为51.81%，在250.00μg／mL浓度下的抑菌率最低，为30.45%；对藤黄微球菌的抑菌率较低，不同发酵物浓度下均低于10%。

2.3.2.4 菌株A－2－7的发酵物对指示菌的抑菌试验结果由图6可知，菌株A－2－7的发酵物对藤黄微球菌没有抑制作用，对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，在1 000.00μg／mL浓度下的抑菌率最高，达 93.19%；对大肠杆菌在1 000.00μg／mL浓度下的抑菌率最高，为43.64%，在3125μg／mL浓度下的抑菌率最低，为2.08%；对乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌在31.25μg／mL浓度下没有抑制作用，在 1 000.00μg／mL浓度下的抑菌率最 高，分别为3616%、4625%，在62.50μg／mL浓度下的抑菌率最低，分别为 995%、3.09%。4287%、42.10%，在62.5μg／mL浓度下的抑菌率均最低，分别为4.15%、11.74%；对乙型副伤寒沙门菌在1 000.00μg／mL浓度下的抑菌率最高，为12.49%，在125.00μg／mL浓度下的抑菌率最低，为1.37%；对金黄色葡萄球菌在1 000.00μg／mL浓度下的抑菌率最高，为14.10%，在250.00μg／mL浓度下的抑菌率最低，为1.91%；对藤黄微球菌的抑制作用最弱，在1 000.00、500.00μg／mL浓度下的抑菌率分别仅为 4.21%、1.78%。

3 结论与讨论

内生真菌普遍存在于植物中，不同的植物能够分离得到不同种类和数量的内生真菌，即使是同一植物也会由于环境、消毒和分离方法的不同而存在差异。本试验采用组织块分离法从中华补血草的根和叶片中分离出11株内生真菌，其中5株来自于叶片，6株来自于根。

对筛选出的11株内生真菌的发酵物进行抗氧化试验，发现菌株A－2－13、A－1－5、A－2－5、A－1－8、A－2－8等具有一定的抗氧化活性，其中在 1 000.00、500.00、25000、125.00μg／mL浓度下菌株A－2－13对DPPH自由基的清除率及菌株A－2－5对羟基自由基的清除率均高于90%。

对筛选出的内生真菌的发酵物进行抑菌试验，发现菌株A－1－5、A－1－16、A－2－5、A－2－7、A－2－13等发酵物的抑菌活性较强，其中对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，抑菌率几乎均高于90%，对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门菌以及金黄色葡萄球菌的抑制作用略低，抑菌率在35%～55%之间，对藤黄微球菌的抑制作用最弱，抑菌率均低于10%。

本试验的结果表明，从野生中华补血草中筛选出的内生真菌具有一定的抗氧化活性和抑菌活性，本研究仅对其做了初步的探讨，其发酵液中活性成分的产量与发酵条件之间有无关系，以及活性成分能否作为药用资源开发利用等均有待进一步研究。

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