USP22对宫颈癌细胞增殖及顺铂化疗敏感性的影响

刘春艳 毛熙光西南医科大学附属医院妇产科（四川泸州 646000）；四川省南充市中心医院妇产科（四川南充 637000）

宫颈癌是女性最高发的恶性肿瘤之一［1］，根治性切除、放化疗均为有效的治疗手段［2］。顺铂是最常用的化疗药物，然而，部分患者由于肿瘤进展而对其敏感性降低，发生耐药抵抗，因此目前亟待明确顺铂耐药抵抗的分子机制［3］。去泛素化酶调节多种细胞生物学进程。研究［4］表明USP22在肿瘤进展中发挥着至关重要的作用，并与化疗药物耐药密切相关［5］，是肿瘤生物治疗的潜在靶点。更为重要的是USP22在宫颈癌组织中高表达，并与宫颈癌不良预后相关［6］。然而，宫颈癌细胞中USP22的表达及其对宫颈癌细胞增殖及顺铂化疗敏感性的影响，尚无研究报道。本研究拟通过qRT⁃PCR技术检测宫颈癌细胞中USP22的表达情况，并分析其对细胞增殖及顺铂化疗敏感性的影响，有望鉴定新的宫颈癌顺铂耐药相关分子。

1 资料与方法

1.1 一般资料 Trizol购于美国Sigma公司，5×PrimeScript RT master和 SYBR premix Ex TaqⅡ试剂盒购于日本TaKaRa公司，CCK⁃8试剂盒购于日本同仁公司，凋亡试剂盒购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反转录 细胞中加入1 mL Trizol裂解至悬液呈透明状。离心上清转移至新离心管中。加入裂解液1/5体积的氯仿，用力振荡至充分乳化。离心吸取上清液，加入等体积异丙醇。弃去上清，75%的乙醇，离心所得沉淀即为所需RNA。反转录：1 μL RNA，2 μL 5×PrimeScript RT master，7 μL去离子水。反应条件为：37 ℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。

1.2.2 实时定量聚合酶链反应 PCR反应体系12.5 μL SYBR premix Ex TaqⅡ，1 μL USP22 或β⁃actin正义链引物，1 μL USP22或β⁃actin反义链引物，2 μL反转录产物，8.5 μL去离子水。反应条件为：预变性 95 ℃ 30 s；扩增95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。

1.2.3 细胞增殖 转染USP22及USP22 siRNAs 48 h至HeLa细胞，而后接种于96孔板中。培养24、48、72、96、120 h后取96孔板加入CCK⁃8试剂，37℃孵育45 min，酶标仪450 nm波长检测吸光度值，测量完毕后，绘制细胞增殖曲线。

1.2.4 细胞存活 细胞接种24 h后，加入顺铂，继续培养 48 h，加入 10 μL CCK⁃8 试剂，孵育 1 h。450 nm测定吸光度值。计算公式为：细胞存活%=（加药细胞OD⁃空白OD）/（对照细胞OD⁃空白OD）×100%。

1.2.5 细胞凋亡 制备细胞悬液，用5 mL PBS洗涤3次后，加入FITC标记的Annexin⁃V（20 μg/mL）10 μL，及PI（50 μg/mL）5 μL，避光反应20 min后，洗涤后利用FACScan流式细胞仪检测。

1.2.6 细胞周期取 制备细胞悬液，用5 mL PBS反复洗涤3次后，弃上清；加入PI 5 μL，避光反应20 min后，洗涤后利用FACScan流式细胞仪检测。

1.2.7 裸鼠荷瘤 4周龄雌性BALB/c⁃nu裸鼠购自南京大学模式动物研究所，于本院SPF级动物房饲养。将处于对数生长期的USP22⁃NC组及USP22⁃siRNA组细胞消化后，调整细胞浓度至5×107个/mL。接种200 μL细胞悬液至5～6周龄雌性BALB/c⁃nu裸鼠腋下。接种后第3天给予各组PBS或顺铂（5 mg/kg）处理，给药频率1周2次，共给药4次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料数据以±s表示，利用方差分析和t检验分析组间USP22的表达差异，利用t检验分析各组增殖、凋亡、周期、细胞存活、体内成瘤体积的差异，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 USP22 mRNA在宫颈癌细胞及人永生化表皮细胞中的表达差异 人永生化表皮细胞系HaCaT的USP22相对表达量为1.000±0.054，宫颈癌细胞HeLa中USP22的相对表达量为3.216±0.251，宫颈癌SiHa细胞中USP22的相对表达量为4.724±0.133。方差分析显示3组间USP22差异存在统计学意义（F=9.135，P＜0.05），t检验分析显示HeLa细胞与HaCaT细胞（t=4.123，P=0.035）及SiHa细胞与HaCaT细胞（t=6.541，P=0.013）中 USP22 mRNA表达水平差异均具有统计学意义，宫颈癌细胞中USP22 mRNA的表达水平较人永生化表皮细胞明显增高。qRT⁃PCR结果显示，USP22⁃siRNA可稳定沉默宫颈癌细胞系中USP22的表达水平（HeLa：t=4.182，P=0.024；SiHa：t=4.573，P=0.021）。见图1。

图1 宫颈癌细胞中USP22的表达Fig.1 Relative expression of USP22 in cervical cancer cells

2.2 USP22对宫颈癌细胞增殖的影响 转染USP22⁃siRNA的HeLa细胞增殖能力较转染USP22⁃NC组增殖能力显著降低（t=4.143，P=0.037）；转染USP22⁃siRNA的SiHa细胞增殖能力较转染USP22⁃NC组增殖能力亦显著降低（t=7.163，P=0.014）。见图2。

图2 USP22对宫颈癌细胞增殖的影响Fig.2 Effects of USP22 on the proliferation of cervical cancer cells

2.3 USP22对宫颈癌细胞顺铂化疗敏感性的影响 给予顺铂处理后，转染USP22⁃siRNA的宫颈癌细胞相对存活率显著低于转染USP22⁃NC组（HeLa：t=4.142，P=0.032；SiHa：t=5.143，P=0.026）。见图3。

2.4 USP22对宫颈癌细胞凋亡的影响 转染USP22⁃siRNAs的宫颈癌细胞凋亡细胞（第2象限+第4象限）比例显著高于转染USP22⁃NC组（HeLa：t=6.145，P=0.012；SiHa：t=3.148，P=0.038）。见图4。

图3 USP22对宫颈癌细胞增殖的影响Fig.3 Effects of USP22 on the chemosensitivity of cervical cancer cells to cisplatin

图4 USP22对宫颈癌细胞凋亡的影响Fig.4 Effects of USP22 on the apoptosis of cervical cells

2.5 USP22对宫颈癌细胞周期的影响 转染USP22⁃siRNAs的宫颈癌细胞G1期细胞比例显著高于转染USP22⁃NC组（HeLa：t=5.332，P=0.021；SiHa：t=4.533，P=0.027），而S期细胞比例则显著低于转染USP22⁃NC组（HeLa：t=3.115，P=0.032；SiHa：t=3.275，P=0.043），两组G2期细胞比例无显著差异。见图5。

图5 USP22对宫颈癌细胞周期的影响Fig.5 Effects of USP22 on the cell cycle of cervical cancer cells

2.6 体内试验检测USP22对肿瘤生长及顺铂化疗敏感性的影响 转染USP22⁃NC组的HeLa细胞肿瘤体积增长速度明显快于转染USP22⁃siRNA组（t=3.242，P=0.033）。更为重要的是，与USP22⁃NC组相比，转染USP22⁃siRNA的HeLa细胞对顺铂的敏感性显著升高（t=2.871，P=0.027）。见图6。

图6 USP22对裸鼠体内肿瘤生长及顺铂化疗敏感性的影响Fig.6 Effects of USP22 on tumor growth and chemosensitivity of HeLa cells to cisplatin in vivo

3 讨论

USP22在心脏和骨骼肌等中有一定程度表达，而在肝脏和肺脏等组织表达量极低［7］。近年来，USP22已被证实在包括肝细胞癌［8］、肺癌［5］、乳腺癌［9］和结肠癌［4］等肿瘤组织中异常高表达，并与肿瘤的不良预后密切相关。值得注意的是，USP22在宫颈癌组织中表达水平显著高于正常宫颈组织，并与FIGO分期、Ki67指数、淋巴结转移情况及组织分级呈正相关，可作为判断宫颈癌总体生存期和无进展生存期的独立预后指标［6］。本研究进一步探索了USP22促进宫颈癌发生发展的分子机制，结果显示，沉默宫颈癌细胞中USP22的表达后，宫颈癌细胞的增殖受到显著抑制，凋亡细胞比例显著增加，细胞周期被阻滞于G1期。

作为hSAGA的亚基，USP22参与组蛋白H2A和H2B的去泛素化，以及组蛋白H4的乙酰化，从而调控基因的转录与表达［10］。H2AX是组蛋白H2A的亚型，在DNA双链断裂修复器，H2AX 139丝氨酸位点将磷酸化［11］。因此，HA2X磷酸化是DNA双链断裂的敏感标记物，并与包括顺铂在内的多种化疗药物抵抗密切相关。USP22可去泛素化Sirt1和果糖二磷酸酶（fructose bisphosphatase 1，FBP1）［12-13］。而 Sir1 可去乙酰化包括 p53 和 Ku70在内的多种蛋白，并参与肿瘤细胞增殖、凋亡、DNA修复及药物抵抗［14］。更为重要的是，顺铂发挥作用的分子机制为其与DNA和非DNA靶点结合，形成交联及单加合物，从而阻断DNA复制和细胞凋亡。本研究前期结果证实USP22在宫颈癌增殖及凋亡的调控过程中发挥着重要的作用。笔者推测USP22可能通过去泛素化及稳定Sirt1的表达而参与肿瘤细胞的化疗药物抵抗。正如笔者预期沉默宫颈癌细胞中USP22的表达后，USP22对顺铂的化疗敏感性显著增高。荷瘤裸鼠模型试验进一步证实，USP22⁃siRNA组细胞在接受顺铂治疗后，肿瘤体积增长速度显著低于USP22⁃NC组。研究结果进一步明确了USP22与肿瘤发生发展及药物抵抗之间的关系，但仍需进一步实验明确USP22是否通过去泛素化Sirt1而参与顺铂耐药的调控。

综上所述，本研究证实了USP22对宫颈癌增殖、凋亡、周期及顺铂化疗敏感性的影响。结果提示，USP22可促进宫颈癌HeLa细胞增殖，抑制其凋亡及顺铂化疗敏感性，是潜在的治疗靶点。

参考文献

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