人羊膜间充质干细胞不同移植方式治疗大鼠脊髓损伤疗效比较

马晶晶 廖旭勇 赵玉洁 喻皇飞

1遵义医学院第三附属医院检验科（遵义 563000）；2遵义医学院第一附属医院检验科（遵义 563000）；3遵义医学院第三附属医院肿瘤科（遵义 563000）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是中枢神经系统的严重性疾病之一，具有高发病率、高致残率和高病死率的特点［1］。目前无SCI特异性治疗手段，手术仅对压迫性及嵌顿性SCI有一定效果，某些激素如甲基强的松龙的治疗效果也非常有限。干细胞移植作为SCI的潜在治疗策略之一，备受学术界的广泛关注［2-3］。目前用于SCI治疗研究的干细胞类型有胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）、神经干细胞（NSCs）和间充质干细胞（MSCs）等。ESCs和iPSCs尽管分化潜能广，却存在致瘤隐患［4］。相比之下，NSCs和MSCs是较为理想的两种干细胞类型，但MSCs具有广泛的组织学来源，且有免疫调节和细胞因子分泌功能，一直是SCI再生策略研究的热点［5-6］。在不同组织来源的MSCs中，人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）具有多系分化特性，低免疫原性，扩增能力强、不牵涉伦理问题等优势，是理想的供源细胞类型［7］。此外，我们之前的研究显示hAMSCs具有对SCI修复的作用［8-9］。而对于SCI的临床治疗而言，原位移植可能有诱发损伤脊髓的再次损伤、出血等风险，能否通过改变移植途径的方式更加有利于SCI的治疗是我们所关心的问题。故本研究拟通过比较经原位和静脉途径移植hAMSCs对SCI大鼠神经功能和组织学修复的效果，探讨hAMSCs经静脉注射途径治疗SCI的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂 （1）人胎盘组织：经知情同意后，无菌采集足月分娩胎盘，HbsAg（-），采集后2 h内进入实验程序。（2）实验动物：清洁级成年雌性SD大鼠28只，体质量（220±20）g，购自重庆第三军医大学动物实验中心。（3）主要试剂：LG⁃DMEM培养基、胎牛血清和胶原酶Ⅱ（Gibco公司），胰酶（Amresco公司），流式荧光抗体（BD公司），抗CD68、GFAP及NeuN抗体（millipore公司），荧光标记二抗（Santa Cruz公司）；流式细胞仪（BD公司）；透射电镜（Hitachi公司）。

1.2 hAMSCs的分离培养 机械分离羊膜，剪碎，用0.05%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）37℃消化羊膜碎片30 min，未消化的组织碎片加入0.75 mg/mL的胶原酶消化提取hAMSCs。LG⁃DMEM完全培养基培养所分离的hAMSCs细胞。取第3代细胞经DAPI标记后用于细胞移植。

1.3 hAMSCs的表型鉴定 调整细胞浓度至1×106/mL，取细胞悬液200 μL分别加入相应荧光标记抗体各3 μL，混匀室温避光孵育20 min，PBS充分洗涤重悬后，流式细胞仪检测分析。同型对照为荧光素标记的小鼠IgG。

1.4 SCI模型建立和细胞移植 SD大鼠28只，分为hAMSCs原位移植组，原位移植对照组，hAMSCs移植注射组（静脉移植对照组，每组各7只。大鼠麻醉后，充分显露T11段脊髓，用手术刀片快速横断并往返复切3次，将两断端轻轻提起以证实完全切断脊髓，逐层缝合伤口。1周后再次暴露损伤脊髓组织，用微量注射器将预备的细胞悬液缓慢注入到脊髓两断端的灰白质交界处，退针前留针5 min。而静脉移植组大鼠则通过尾静脉注射相同数量的细胞悬液。对照组以PBS替代。术后截瘫护理，定时协助受试大鼠排尿排便。

1.5 行为学评价 采用BBB评分法［10］。细胞移植后每周一次对大鼠进行后肢功能测评，共分22个等级，后肢全瘫为0分，完全正常为21分。每次测评均在同一时点进行，观察时间为5 min，测评前排空膀胱。

1.6 组织学检测 实验截止时处死的各组大鼠，取出损伤段脊髓，置于30%蔗糖4℃固定后切片，行组织学检测：（1）HE染色，观察组织结构；（2）免疫荧光染色：切片洗涤封闭后分别滴加NeuN（1∶100）、GFAP（1∶200）、CD68（1∶100）抗体，对照组用PBS替代一抗，4°C过夜，洗涤后滴加相应荧光二抗室温孵育2 h，充分洗涤后封片观察；（3）透射电镜观察髓鞘形态：组织经戊二醛和四氧化锇固定后，环氧树脂包埋，切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染色观察。

1.7 统计学方法 数据以均值±标准差表示，采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析。组间差异比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.01表示差异有显著意义。

2 结果

2.1 hAMSCs形态观察 原代培养的hAMSCs 12 h即有部分细胞贴壁，3 d后贴壁细胞迅速增多，由圆形，卵圆形转变为梭形、多角形生长（图1A）。传代培养3 d后hAMSCs融合近95%以上，细胞呈长梭形、纺锤形，单层漩涡放射状生长（图1B）。

图1 hAMSCs生长形态（×200）Fig.1 Morphology of cultured hAMSCs（× 200）

2.2 hAMSCs表型鉴定 FCM分析结果表明，培养的hAMSCs高表达典型MSCs表面标记，如CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，几乎不表达CD80、CD86、CD45、CD34及HLA⁃DR（图2）。

图2 流式细胞术分析hAMSCs表型Fig.2 Phenotypic analysis of hAMSCs by FCM

2.3 SCI大鼠行为学观察 BBB评分如图3所示，hAMSCs移植后1周，原位移植组大鼠和尾静脉移植组大鼠的BBB评分分别是3.50±1.48、2.64±0.74，两组之间比较无统计学差异，但与同时点PBS组大鼠的分值（分别是0.71±0.67、0.86±0.61）相比，差异有显著意义（均P＜0.05）；从术后1周到第6周，无论是移植组还是相应对照组大鼠BBB评分均有升高趋势，但前两组上升幅度明显高于对照组。至第6周，原位移植组大鼠和尾静脉移植组大鼠BBB分值分别达6.71±0.70和6.93±1.28，均高于相应时点的PBS对照组评分（均P＜0.05），而原位移植组和尾静脉移植组之间比较差异仍无统计学意义。

图3 hAMSCs移植后各组大鼠BBB分值变化Fig.3 BBB scores in rats of different groups with SCI after hAMSCs transplantation

2.4 hAMSCs的体内植活 hAMSCs移植后第6周，无论是原位移植组还是尾静脉移植组大鼠损伤脊髓节段组织切片中均可见DAPI标记阳性细胞存在（图4A、B）。原位移植组中DAPI阳性细胞主要沿针道注射处分布于脊髓灰白质组织之中，相对较集中（图4A）；而尾静脉移植组DAPI阳性细胞散在分布于组织中（图4B）。

图4 hAMSCs在大鼠受损脊髓组织内的植活（×100）Fig.4 Survival of hAMSCs in injured spinal cord of rats after transplantation（× 100）

2.5 损伤脊髓组织学观察 HE染色结果显示（图5），hAMSCs移植后第6周，原位移植组、尾静脉移植组大鼠横断损伤区上下两残端脊髓组织得以有效整合连接，连接处见各种细胞增生，排列紊乱无规则。同时也有少量小的空洞形成，可见炎细胞浸润（图5A、C）。PBS对照组大鼠SCI区组织呈现较大的空洞及明显的囊腔并伴随细胞的紊乱排列，损伤脊髓段中间几乎未见组织结构相连，仅在其两侧有少许组织得以连接两残端组织（图5B、D）。

2.6 损伤脊髓组织免疫荧光染色 免疫荧光染色结果显示（图6），hAMSCs细胞移植第6周，hAM⁃SCs原位移植组和尾静脉移植组在损伤脊髓组织可见大量NeuN染色阳性神经细胞，而PBS对照组脊髓组织中的NeuN阳性细胞明显减少。GFAP阳性神经纤维在hAMSCs原位移植组和尾静脉移植组损伤段脊髓组织中的表达相似，呈细丝状均质散在分布；而其在相应的PBS对照组大鼠的受损脊髓则呈集束状，形状粗大，相互汇集缠绕，主要分布于受损脊髓段的空洞和囊腔边缘；CD68的表达分布与GFAP颇为相似，主要集中受损脊髓囊腔和空洞边缘，在hAMSCs原位移植组和尾静脉移植组，CD68阳性细胞在损伤段脊髓组织内呈均匀散在分布，未见明显聚集成簇现象。

2.7 损伤脊髓组织髓鞘观察 如图7显示，脊髓损伤hAMSCs细胞移植后第6周，hAMSCs原位移植组和尾静脉移植脊髓组织中见部分板层松懈，但髓鞘结构规则完整，呈圆形或卵圆形（图7A、C）。而在PBS对照组中，损伤段脊髓组织均可见大量形态异常的髓鞘结构，髓鞘板层结构严重松解、扭曲，整体呈空泡化改变明显，部分髓鞘结构高度水肿变形，甚至崩解，以原位移植对照组更甚（图7B、D）。

3 讨论

尽管MSCs移植治疗SCI具有广阔的应用前景，但也存在着很多问题需要关注和探索。除了供源细胞的组织学来源、类型和分化潜能外，合适的、方便快捷的移植途径更符合临床需求。我们之前的研究首次证实了hAMSCs原位移植具有对SCI大鼠组织学修复和神经功能重建的能力［8-9］，在本研究中，我们发现静脉移植hAMSCs对SCI大鼠的神经功能和组织结构同样具有修复作用。hAMSCs能够在移植后第6周的脊髓损伤段组织中植活，说明静脉移植hAMSCs仍可迁徙到病损组织。hAMSCs这种能力和其本身固有的低免疫原性不无关系［11］。由于不表达CD80、CD86和HLA⁃DR等多种免疫相关分子，hAMSCs移植后不引起宿主的排异，能够通过体循环定植于损伤部位发挥修复作用的特点，是hAMSCs作为供源细胞的优势之一。

在实验中，我们观察到hAMSCs移植后NeuN阳性表达神经元细胞明显增多。而GFAP阳性神经纤维在对照组损伤端变形打结，而在移植组却均匀分布的现象充分说明hAMSCs移植不仅利于促进神经元细胞的存活，还可通过抑制胶质细胞增生减少胶质瘢痕的形成。此外，我们还观察了CD68阳性小胶质细胞在PBS组脊髓缺损残端聚集。研究显示，在SCI后损伤早期，小胶质细胞活化，释放白细胞介素、TNF等大量细胞因子加重炎症反应，对神经元产生毒害作用。而在晚期小胶质细胞又可通过清除细胞间的毒素并分泌神经营养因子起到神经保护作用［12］。鉴于小胶质细胞在神经组织损伤修复过程中的作用，结合我们的结果，我们怀疑hAMSCs移植可调控小胶质细胞的生物学行为，减轻了其对神经元的毒害作用，使得损伤后组织向有利于修复的方向转化。

对于MSCs移植促进SCI组织和功能修复的机制尚不清楚，目前认为主要有以下几种方式：（1）MSCS在微环境作用分化成神经元细胞发挥神经传导替代作用，有助于神经功能的修复［13］；（2）MSCS通过分泌多种神经营养因子及细胞因子，进而改善神经功能［14］；（3）MSCs通过某种方式激活神经组织预存的NSCs，调节组织再生修复［15］。（4）移植的MSCs形成有益微环境，引导轴突生长以促进神经系统的修复［16］。理论上讲，经不同途径植入hAMSCs，可能会由于作用机制的不同，所产生的治疗效果亦存在一定差异。而我们的结果却显示，两种移植方式无论在组织学修复还是神经功能改善的程度上有着相似的效果，说明静脉移植途径同样是hAMSCs治疗SCI的有效途径的同时，也提示着这两种方式有着相似的修复机制。研究显示，hAMSCs可以分泌血管内皮生长因子、神经生长因子、神经营养素3、脑钠素、脑源性神经营养因子等多种细胞因子和营养因子参与神经细胞的存活，迁移或分化［17］。大量营养因子或细胞因子的分泌又可改善机体损伤后的整体状态和局部微环境［18］，这可能是静脉移植途径具有原位移植相同修复效果的机制之一。而hAMSCs究竟产生了哪些因子参与SCI的修复，则是我们下一步需要深入的研究的内容。

图7 损伤段脊髓组织中髓鞘形态（×5 000）Fig.7 Morphology of medullary sheath in injured spinal cord（×5 000）

参考文献

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