间充质干细胞干预对糖尿病脓毒症大鼠的肺损伤及肺脏炎症微环境作用的研究

2018-05-17郑一玮贺能英陈珍严启滔莫泽珣郭振辉

实用医学杂志 2018年4期

郑一玮贺能英陈珍严启滔莫泽珣郭振辉，

1广州医科大学（广州 510182）；2广州军区广州总医院老年重症医学科（广州 510010）；3广东省老年感染与器官功能支持重点实验室（广州 510010）

脓毒症是由感染引起的宿主免疫反应失调所导致的致命性器官功能障碍［1］，不仅是发达国家非冠心病重症监护病房中死亡的主要原因，也是最常见的死亡原因［2］。严重脓毒病的全球年发病率估计为每10万人年300例，占ICU入院的10%［3-4］。由于人口老龄化和新出现的抗生素耐药性，脓毒症在临床上常常与一种或多种基础疾病合并出现。根据国际糖尿病联盟发布的第七版《糖尿病概览》［5］，2015年全球糖尿病患病人数73亿，预计到2040年，全球糖尿病人数将增长为90亿，糖尿病已成为人口基数最为庞大的基础疾病之一。在脓毒症相关的科研领域，有多种动物模型，其中以盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture，CLP）最为经典［6］。然而，单一疾病的动物模型与临床实际情况不符。因此，我们需要更贴合临床实际情况的复合动物模型。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）也被称为多能间充质基质细胞，是可分化为间质谱系的多能细胞，并可分泌具有促进受损组织再生的旁分泌作用的细胞因子和生长因子［7］。由于间充质干细胞具有抗炎-促炎平衡调节作用，其对脓毒症的治疗作用已成为新的研究热点［7-8］。2016年1月至2017年6月，本研究拟建立SD大鼠2型糖尿病（type 2 diabetic rat model，T2DM）脓毒症复合动物模型，探讨间充质干细胞对糖尿病脓毒症大鼠肺组织的影响。

表1 大鼠空腹血糖及体质量变化Tab.1 Fasting blood glucose and body mass changes of rat ±s

注：HDFB为“注射链脲佐菌素前”，HDFA为“注射链脲佐菌素后”，STZ3D为“注射链脲佐菌素后第3天”，STZ7D为“注射链脲佐菌素后第7天”，STZ14D为“注射链脲佐菌素后第14天”，STZ21D为“注射链脲佐菌素后第21天”，STZ28D为“注射链脲佐菌素后第28天”

空腹血糖（mmol/L）体质量（g）组别HDFB HDFA STZ3D STZ7D STZ14D STZ21D STZ28D正常大鼠4.68±0.64 6.69±1.01 10.88±3.18 13.30±3.09 13.34±3.67 9.30±1.36 8.19±0.98 T2DM大鼠4.63±0.79 6.84±1.37 19.67±4.87 21.70±4.20 22.01±4.96 19.89±4.19 21.43±3.33 t值0.292 0.259 10.447 11.125 9.484 16.479 26.093 P值0.112 0.131 0.078 0.005 0.003 0.000 0.000正常大鼠190.88±9.17 442.40±33.57 462.94±47.15 435.48±43.69 461.73±48.12 494.38±37.72 528.15±47.42 T2DM大鼠189.29±29.10 413.90±68.91 392.55±65.51 377.03±65.28 366.61±36.28 356.38±64.03 342.45±61.71 t值0.361 2.581 6.063 5.171 8.074 12.899 16.505 P值0.204 0.412 0.293 0.525 0.479 0.172 0.098

1 材料与方法

1.1 动物模型制备与分组

1.1.1 糖尿病-脓毒症大鼠模型构建 SPF级健康雄性SD大鼠共96只购自广东省动物中心，体质量170～220 g，5～6周龄。高脂高糖喂养4周后，按40 mg/kg腹腔注射链脲佐菌素（美国Sigma公司），72 h后测空腹血糖≥16.7 mmol/L，SD大鼠T2DM模型成功。采用CLP术构建糖尿病-脓毒症大鼠模型。

1.1.2 动物分组随机分为8组：非糖尿病大鼠对照组（NDM⁃Control组），非糖尿病大鼠假手术组（NDM⁃Sham组），非糖尿病大鼠CLP组（NDM⁃CLP+Saline组），非糖尿病大鼠CLP后骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）（广州赛业公司）治疗组（NDM⁃CLP+BMSCs组）；糖尿病大鼠对照组（T2DM⁃Control组），糖尿病大鼠假手术组（T2DM⁃Sham组），糖尿病大鼠CLP组（T2DM⁃CLP+Saline组），糖尿病大鼠CLP后BMSC治疗组（T2DM⁃CLP+BMSCs组）。每组4个时间点：术后6、12、18、24 h。

1.2 标本的采集与处理水合氯醛（3 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取血后处死大鼠，取肺组织100 mg，制成匀浆，用于ELISA检测。另取肺组织置于4%多聚甲醛中固定，常规制成厚为5 μm的石蜡切片，用于HE染色。

1.3 酶联免疫ELISA法肺泡表面活性物质相关蛋白⁃D（surfactant protein⁃d ，SP⁃D）ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）ELISA 试剂盒、干扰素⁃γ（interferon⁃γ，IFN⁃γ）ELI⁃SA试剂盒、白细胞介素⁃10（interleukin⁃10，IL⁃10）ELISA试剂盒均购自武汉华美公司。按试剂盒说明书步骤进行检测。

1.4 HE染色 5 μm石蜡切片浸入二甲苯脱蜡，苏木素染色，1%盐酸乙醇分化，0.2%氨水返蓝，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶固封，制成HE染色片。

1.5 统计学方法计数资料用绝对数表示，计量资料用均数±标准差表示，两组及多组间样本均数的比较采用t检验和单因素方差分析，不同时间点细胞因子水平比较采用重复测量的方差分析。采用SPSS 21.0统计软件（IBM，Armonk，NY，USA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠空腹血糖和体质量比较 SD大鼠高糖高脂喂养4周，大鼠体质量升高；注射STZ后，大鼠饮水量、尿量明显增加，空腹血糖升高，体质量下降，出现典型的糖尿病“三多一少”症状。CLP术后，大鼠体温上升，寒战，立毛，全身虚弱，精神萎靡，蜷缩成团，反应迟钝（表1及图1）。

2.2 大鼠腹腔脏器外观 CLP术后24 h解剖非糖尿病大鼠，打开腹腔时见盲肠结扎穿孔处肿胀紫黑，腹腔渗液较少，局部肠管扩张不明显；CLP术后24 h解剖糖尿病大鼠，打开腹腔时有恶臭气味，盲肠结扎穿孔处肿胀发白，脏器组织质地松脆，腹腔内积液较多，肠管附着脓苔，小肠充血水肿，肠管明显扩张（图2）。

2.3 肺组织病理学检查显微镜下见各时间点的对照组及假手术组大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁菲薄，血管无扩张无充血。但CLP组及MSC治疗组大鼠的肺组织随着时间推移，血管逐渐扩张、充血，肺泡结构渐渐破坏，肺泡间隔愈发增厚，肺泡腔和肺间质内红细胞不断增多（图3～6）。

图1 链脲佐菌素注射后大鼠空腹血糖及体质量水平变化曲线Fig.1 Changes of fasting blood glucose and body mass after streptozotocin injection in rats

图2 大鼠盲肠结扎穿孔（CLP）术后24 h的解剖观察Fig.2 Anatomical observation 24 hours after cecal ligation and puncture（CLP）in rats

图4 假手术组大鼠肺组织石蜡切片HE染色（×40）Fig.4 HE staining of paraffin section of rat lung tissue in sham operation group（× 40）

图5 CLP组大鼠肺组织石蜡切片HE染色（×40）Fig.5 HE staining of paraffin section in the lung tissue of group CLP rats（× 40）

图6 CLP术后MSC治疗组大鼠肺组织HE染色（×40）Fig.6 HE staining of lung tissue of rats in MSC treatment group after CLP（× 40）

表2 大鼠肺组织SP⁃D水平比较Tab.2 SP⁃D levels in rat lung tissue ±s，ng/mL

注：*△同一时间点vs.NDM⁃Control；◇同一时间点vs.NDM⁃Sham；☆同一时间点vs.NDM⁃CLP+Saline；▲同一时间点vs.T2DM⁃Control；◆同一时间点vs.T2DM⁃Sham；★同一时间点vs.T2DM⁃CLP+Saline比较P＜0.05

NDM⁃CONTROL NDM⁃Sham NDM⁃CLP+Saline NDM⁃CLP+BMSCs T2DM⁃CONTROL T2DM⁃Sham T2DM⁃CLP+Saline T2DM⁃CLP+BMSCs F值P值6 h 2.41±0.58 3.6±1.14 7.55 ± 0.46△◇7.14 ± 1.13△◇2.25±0.31 4.36±0.53 7.35 ± 0.21▲◆6.92 ± 1.02▲◆2.532 0.059 12 h 3.87±1.77 4.54±1.05 13.72 ± 2.15△◇7.59± 0.88△☆4.02±1.98 4.41±0.50 13.23 ± 3.74▲◆7.10 ± 0.86▲◆3.607 0.016 18 h 3.15±1.54 5.65±0.93 33.58 ± 15.50△◇33.81 ± 11.69△◇4.43±1.38 8.77±1.41 17.71±5.53▲10.73±1.27▲6.269 0.001 24 h 3.58±1.65 4.41±1.31 58.40 ± 26.87△◇44.40 ± 1.75△◇3.78±0.76 9.97±1.81 34.57 ± 12.72▲◆7.46 ± 2.14◆★8.468 0.000 F值531.554 170.463 30.576 290.439 137.689 1 142.873 39.230 3 307.094 P值0.002 0.006 0.031 0.003 0.007 0.001 0.025 0.000

2.4 酶联免疫法检测SP⁃D、TNF⁃α、IFN⁃γ、IL⁃10表达水平假手术及CLP术后，非糖尿病大鼠CLP组和MSC治疗组SP⁃D水平升高，24 h达高峰，CLP组和MSC治疗组各时间点SP⁃D水平比较无统计学差异（P＞0.05）；糖尿病大鼠组MSC治疗组SP⁃D水平无升高，24 h时间点SP⁃D水平与CLP组比较有统计学差异（P＜0.05，表2及图7）。

假手术及CLP术后，非糖尿病大鼠组CLP组和MSC治疗组的TNF⁃α水平明显升高，CLP组和MSC治疗组各时间点TNF⁃α水平比较无统计学差异（P＞0.05）；糖尿病大鼠组的MSC治疗组TNF⁃α水平无升高，18 h和24 h时间点TNF⁃α水平与CLP组比较有统计学差异（P＜0.05，表3及图8）。

假手术及CLP术后，非糖尿病大鼠组的CLP组IFN⁃γ水平明显升高，24 h达高峰，18 h和24 h时间点CLP组和MSC治疗组IFN⁃γ水平比较有统计学差异（P＜0.05）；糖尿病大鼠组的CLP组和MSCs治疗组各时间点IFN⁃γ水平比较无统计学差异（P＞0.05，表4及图9）。

图7 非糖尿病组与糖尿病组大鼠肺组织SP⁃D水平变化曲线Fig.7 SP⁃D levels in lungs of non⁃diabetic and diabetic rats

表3 大鼠肺组织TNF⁃α水平比较Tab.3 Comparison of TNF⁃α levels in rat lung tissue ±s，pg/mL

NDM⁃CONTROL NDM⁃Sham NDM⁃CLP+Saline NDM⁃CLP+BMSCs T2DM⁃CONTROL T2DM⁃Sham T2DM⁃CLP+Saline T2DM⁃CLP+BMSCs F值P值6 h 113.18±19.19 129.78±18.36 138.58± 7.20△148.00± 12.73△105.21±7.50 97.01±4.73 122.79± 10.18◆124.48± 20.59◆1.037 0.444 12 h 93.79±6.30 143.33±4.01△227.24±30.01△324.54±21.66△107.16±14.44 114.54±7.30 213.32 ± 9.50▲◆234.37 ± 43.98▲◆4.881 0.004 18 h 111.25±11.57 146.37±21.50 326.52 ± 103.55△◇569.62 ± 97.00△◇114.84±25.40 192.67±18.97 410.04± 112.36▲159.07± 13.14◆★5.181 0.003 24 h 108.06±14.96 148.99±14.51 635.29 ± 28.30△◇658.53 ± 41.02△◇118.32±20.62 282.59 ± 31.48▲◆616.75 ± 60.79▲◆138.52 ± 5.46◆★2.795 0.042 F值474.086 1 806.986 969.773 4 945.609 375.413 3 969.655 175.644 308.911 P值0.002 0.001 0.001 0.000 0.003 0.000 0.006 0.003

表4 大鼠肺组织IFN⁃γ水平比较Tab.4 Rat lung tissue IFN⁃γ levels ±s，pg/mL

NDM⁃CONTROL NDM⁃Sham NDM⁃CLP+Saline NDM⁃CLP+BMSCs T2DM⁃CONTROL T2DM⁃Sham T2DM⁃CLP+Saline T2DM⁃CLP+BMSCs F值P值6 h 0.40±0.03 0.66±0.19 2.06 ± 0.26△◇1.57 ± 0.50△◇0.36±0.04 0.45±0.43 1.69 ± 0.45▲◆1.71 ± 0.27▲◆4.440 0.006 12 h 0.87±0.57 1.40±0.28 2.94 ± 0.11△◇3.01 ± 0.56△◇0.84±0.60 0.75±0.12 2.07 ± 0.08▲◆2.00 ± 0.78▲◆2.092 0.105 18 h 0.62±0.14 1.55±0.12 5.67 ± 2.19△◇2.70 ± 0.94△☆0.52±0.41 1.46±0.30 4.30 ± 1.17▲◆2.72±0.65▲2.547 0.058 24 h 0.90±0.47 1.70±0.23 10.98± 1.60△◇2.91± 2.80◇☆1.24±0.33 1.39±0.52 5.55± 1.10▲◆3.73± 0.45▲◆6.440 0.001 F值715.350 543.546 164.799 309.323 19.277 437.627 4677.537 126.473 P值0.001 0.002 0.006 0.003 0.048 0.002 0.000 0.008

假手术及CLP术后，非糖尿病大鼠组的CLP组和MSC治疗组IL⁃10水平波动明显，CLP组和MSC治疗组在24 h的IL⁃10水平比较有统计学差异（P＜0.05）；糖尿病大鼠组的MSC治疗组在时间点12 h的IL⁃10水平升高，而后下降，CLP组和MSC治疗组在12 h的IL⁃10水平比较有统计学差异（P＜0.05），18 h和24 h无统计学差异（P＞0.05，表5及图10）。

图8 非糖尿病与糖尿病组大鼠肺组织TNF⁃α水平变化曲线Fig.8 TNF⁃α levels in lung tissue of non⁃diabetic and diabetic rats

图9 非糖尿病与糖尿病大鼠肺组织INF⁃γ水平变化曲线Fig.9 INF⁃γ levels in lung tissue of non⁃diabetic and diabetic rats

表5 大鼠肺组织IL⁃10水平比较Tab.5 Comparison of IL⁃10 levels in rat lung tissue ±s，pg/mL

NDM⁃CONTROL NDM⁃Sham NDM⁃CLP+Saline NDM⁃CLP+BMSCs T2DM⁃CONTROL T2DM⁃Sham T2DM⁃CLP+Saline T2DM⁃CLP+BMSCs F值P值6 h 5.24±0.37 6.20±1.20 27.98 ± 6.82△◇31.15 ± 7.46△◇5.06±1.41 4.56±1.44 27.00 ± 7.11▲◆26.55 ± 9.30▲◆2.807 0.041 12 h 4.52±1.73 7.26±1.54 17.84 ± 7.87△◇16.61 ± 1.44△◇6.97±1.51 7.44±0.68 17.14 ± 4.20▲◆37.22 ± 9.57▲◆★6.509 0.001 18 h 5.60±0.80 9.46±2.03 30.80 ± 9.14△◇29.99 ± 2.08△◇5.72±0.89 16.52±1.48 18.44±6.16▲26.97±15.44▲2.742 0.045 24 h 6.60±1.59 11.01±2.20 5.27±0.33△25.63± 8.30◇☆5.92±2.43 21.42±1.68▲11.27±2.71◆9.06±2.07◆2.179 0.093 F值127.664 402.693 38.180 206.163 100.600 868.210 427.205 43.086 P值0.008 0.002 0.025 0.005 0.010 0.001 0.002 0.022

图10 非糖尿病与糖尿病大鼠肺组织IL⁃10水平变化曲线Fig.10 IL⁃10 levels in lung tissue of non⁃diabetic and diabetic rats

3 讨论

目前认为，病原微生物与宿主之间复杂的免疫/炎症反应是脓毒症主要病理生理机制之一，脓毒症早期机体可能表现为失控的持久性炎症反应，晚期则出现免疫抑制，导致患者死于继发二次真菌、细菌或病毒感染［9-10］。纵观脓毒症发展过程，炎症和抗炎反应之间的平衡至关重要［11］。因此我们在探讨脓毒症的治疗方案时，应首先考虑机体所处免疫状态。糖尿病作为人口基数庞大的基础疾病，高血糖影响患者机体免疫反应以及免疫应答的不同部分［12］。由此，本研究选择建立糖尿病-脓毒症复合动物模型来模拟更真实的脓毒症临床现状。

细胞因子是严重感染“炎症反应”的重要组成部分。间充质干细胞具有免疫调节特性［7］，众多研究人员着眼于其对脓毒症的治疗作用［8］。多个动物模型研究表明，脓毒症与多种细胞因子，包括 TNF⁃α、INF⁃γ、IL⁃10的释放增加相关，而消除或抑制这些细胞因子的释放可改善动物模型的生存［8，11，13-21］。一部分研究报道了MSC治疗能降低促炎细胞因子，即 IFN⁃γ及 TNF⁃α的水平［13-14，18-24］。另一些研究则表明抗炎细胞因子IL⁃10的水平升高伴随着其余抗炎细胞因子水平的降低［13-14，18-24］，但还一些研究显示MSC对IL⁃10水平的并无影响［15，22，25-26］。脓毒症时肺脏主要表现为急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征（acute lung injury and acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS），剧烈的炎症反应是其发病关键［27］，研究表明脓毒症时肺泡表面活性蛋白（surfactant protein，SP）水平升高，并可能导致预后不良和更高死亡风险［28-29］。

本研究显示，CLP术后，随着时间推移，非糖尿病与糖尿病脓毒症大鼠的肺组织均出现血管扩张、充血，肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚，以及肺泡腔和肺间质内红细胞不断增多等改变，但MSC干预在CLP术后24 h内对肺组织这些病理改变并无改善。MSC干预在24 h以后对肺组织的病理改变有待进一步观察和研究。肺组织中SP⁃D、TNF⁃α和IFN⁃γ表达水平随着时间的发展逐渐增加，IL⁃10水平则呈现“升高-下降-再升高-再下降”的趋势；MSC干预增加非糖尿病脓毒症大鼠的肺组织SP⁃D、TNF⁃α与IL⁃10水平，减少IFN⁃γ水平；MSC干预减少糖尿病脓毒症大鼠的肺组织SP⁃D与TNF⁃α水平，但对IFN⁃γ水平无影响，对IL⁃10水平起到先增加后减少的作用。原因考虑可能有以下几点。

（1）本研究选用骨髓来源的间充质干细胞，而以往的部分研究选用脂肪来源的间充质干细胞［13，17，26］。ELMAN 等［17］认为，骨髓来源的间充质干细胞作为细胞治疗用于内毒素性休克，比脂肪来源的间充质干细胞可能更有效。

（2）本研究着重关注细胞因子在肺组织中的表达水平，使用肺组织匀浆进行检测。以往的研究大多聚焦于这些细胞因子在血清或血浆中的水平变化［13-14，18-26］，而较少着眼于其在具体脏器中的变化。SHIRLEY等［15］研究表明，MSC显着降低了脓毒症小鼠血浆中IL⁃6、IL⁃1β、IL⁃10的表达水平；但肺泡灌洗液中IL⁃10的表达水平则没有受到影响。

（3）脓毒症前3 d主要处于促炎反应阶段，而本研究中复合模型的观察时间节点为CLP术后6、12、18以及24 h，正处于早期促炎反应阶段，即免疫活化状态［30］。研究表明，体内的炎症状态可能影响MSC的免疫抑制功能［31］，而糖尿病可以损伤机体免疫功能，导致机体免疫平衡失调，对于同样的脓毒症，T2DM机体或处于促炎反应的高峰阶段，此时糖尿病基础的脓毒症可能影响MSC的作用［31］。

综上所述，通过建立糖尿病和非糖尿病大鼠脓毒症模型，可观测到糖尿病和非糖尿病大鼠对脓毒症的炎症反应和器官损伤的不一致，可能与其各自体内免疫状态不同相关。间充质干细胞对脓毒症的炎症与器官损伤有影响，但其具体作用取决于机体免疫状态及间充质干细胞干预时机的选择；间充质干细胞的体外免疫状态及如何选择干预时机，尚在探索阶段，需进一步研究。

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