豨红通络口服液改善小鼠炎性和神经病理性疼痛的作用研究*

张 建，黄凤珍，张 炜，李小军，李玉桑，唐潇旖，胡烨胤，商洪才，唐和斌，田贵华

豨红通络口服液是由豨莶草、红花、川牛膝3味药材组成的复方制剂[1]，在临床上治疗瘀血阻络所致的中风之症等。复方制剂中的豨莶草具有祛风湿、通经络、清热解毒的功效；红花可活血通经、化瘀止痛、活血解毒[2]；川牛膝具有活血化瘀、利尿通淋之作用[3]，对巴豆油致小鼠耳廓肿胀有良好的缓解效果[4]。亦有报道指出[5]，豨红通络口服液能够迅速通过血脑屏障进入脑组织，可对脑部疼痛发挥治疗作用。脑卒中后中枢性疼痛属于神经病理性疼痛，是中风病最为棘手的症状之一[6]。因此，本研究拟探讨豨红通络口服液对完全弗氏佐剂等起炎物质诱发的炎性肿胀、炎性疼痛和脑出血诱发的神经病理性疼痛的调控规律，初步评价其作用机制，为进一步在临床上推广使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物 选用SPF级昆明雄性小鼠（6～9周龄，体质量 18～22 g；合格证编号：42000600021454），购买自湖北省实验动物研究中心。

1.2 药物与试剂 本实验所用的中成药为豨红通络口服液（吉林省通化卫京药业股份有限公司提供，批号20170201）；完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，批号1001541106）；醋酸（美国Sigma公司，批号20170122）；二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号10023418）；IV型胶原酶（美国Sigma公司）；苏木精（南京建成，批号20161209）；伊红（美国Sigma公司，批号114813194）；甲醛溶液（国药试剂，批号20160229）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号10009218）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司，批号10010018）；30%过氧化氢溶液；胰蛋白酶（美国 GIBCO，10270-106）；0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，p H 7．2）；兔源 IBA-1 多克隆抗体（美国Millipore，ABN67）；兔源GFAP多克隆抗体（美国Caymen，BA0056）；山羊抗兔Ig G（武汉博士德公司，BA1054）。

1.3 仪器 脑立体定位仪（美国Stoelting，型号ST-51903）；热痛仪（美国 Ugo Basile，型号 37370）；脱水机（德国莱卡，型号TP1020）；包埋机（德国莱卡，型号 EG1150）；冰冻切片机（德国莱卡，型号CM3050S）；手持式测痛仪（北京硕林苑科技有限公司，型号SLY-HFM）；多光谱成像系统（美国Nuance，型号N-MSI-FX）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型建立与给药剂量 1）小鼠耳廓肿胀模型的建立，于小鼠右耳耳廓涂抹50μL二甲苯（Xylene）[7]。2）小鼠炎性疼痛模型的建立，在小鼠左足足底注射50μL完全弗氏佐剂（CFA）[8]。3）小鼠醋酸扭体模型的建立，用注射器腹腔注射0．6%的醋酸（0．01 mL/g）[9]。4）小鼠脑卒中疼痛模型的建立，在脑定位仪于左脑（bregma-0．2 mm，midline 2．0 m m，surface 3．0 mm）注入胶原酶（0．25 μL，0．025 U），造成脑卒中后中枢性疼痛模型[6]。按照4种不同的造模方式，随机将各个模型的小鼠分成正常组、模型组、低剂量治疗组（2μL/g）和高剂量治疗组（10μL/g），每组5只。

1.4.2 观测指标

1.4.2.1 肿胀与疼痛阈值测定 分别于0或1/48、1、3、5 d检测小鼠的疼痛阈值[10]、足趾肿胀和耳廓肿胀程度。

1.4.2.2 苏木精-伊红（HE）染色与Nissl染色、免疫组织化学染色 于第5天实验结束后，炎性疼痛模型各组小鼠处死后取左足足底皮肤，进行石蜡包埋，行HE染色：观察组织的炎症变化情况，每组小鼠选取2张切片，二甲苯脱蜡3次10 min，常规乙醇梯度脱水，苏木素核染5 min，温水返蓝5 min，伊红质染 30 s，封片[11]。

脑卒中模型各组小鼠进行心脏灌注，断头取脑组织置福尔马林溶液中固定，进行石蜡包埋，行Nissl染色：首先脑组织冰冻切片，蒸馏水2 min，Nissl染色液染色3～10 min，蒸馏水洗涤2次；然后95%的乙醇依次5 s，2 min，2 min脱水；接着二甲苯透明2次，每次5 min，最后用中性树脂胶封片。

免疫组织化学染色：每组小鼠任意选2张切片，常规二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水。滴加0．3%双氧水室温30 min，0．1%胰酶室温1 h，血清封闭40 min后滴加兔抗鼠一抗溶液-4℃保存过夜，加羊抗兔二抗室温孵育30 min后，DAB发色，置于光学显微镜下观察神经细胞和胶质细胞的变化情况，并运用多光谱技术对免疫组化的结果进行定量分析[12]。

1.5 统计方法 豨红通络口服液灌胃（每日1次），然后在相应的时间点（1/48 d、1 d、3 d、5 d）进行炎性肿胀程度、疼痛行为变化以及受损脑组织病理损伤进行分组统计，进行数据收集。同时，实验整体数据采用均数±标准差（x±s）的方法对小鼠耳廓炎性肿胀，足趾炎性肿胀，扭体抑制率，足底机械痛阈，足底热痛阈数据处理；采用重复测量方差分析，多光谱定量的比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 豨红通络口服液对二甲苯诱发小鼠耳廓炎性肿胀的影响 通过二甲苯涂抹小鼠耳廓，诱发了明显肿胀。耳廓肿胀在第1天达到峰值（模型组肿胀至空白组的（202．02±5．53）%。而相比模型组小鼠，给予豨红通络口服液低剂量（2μL/g）、高剂量（10μL/g）治疗组的耳廓肿胀程度，得到了明显缓解，并随着给药次数的增加，效果越来越显著，在第5天时高剂量治疗组治疗效果最佳（模型组肿胀至空白组的（202．02±7．14）%，而低剂量和高剂量的治疗组分别降至空白组的（162．33±3．27）%与（151．52±8．40）%。见表 1。

表1 各组小鼠耳廓肿胀程度（x±s）Tab.1 Miceauricleswelling（x±s）mm

2.2 豨红通络口服液对完全弗氏佐剂诱发小鼠足趾炎性肿胀的影响 为了确证豨红通络口服液对炎性肿胀的改善效果，选用完全弗氏佐剂诱发小鼠足底炎性肿胀模型。见表2。完全弗氏佐剂诱发了小鼠的足趾炎性肿胀，并在第1天就达到峰值[模型组肿胀至空白组的（151．77±1．73）%]。相比模型组小鼠，豨红通络口服液低剂量和高剂量灌胃处理的小鼠均有明显恢复，且高剂量治疗组治疗效果较好（模型组肿胀至空白组的（149．89±1．73）%，而低剂量治疗、高剂量治疗组分别降至空白组的（135．00±1．25）%与（130．15±1．22）%。为观察小鼠足趾炎性肿胀的真实性，笔者在行为学检测结束后取下了小鼠双足，并进行固定、包埋、HE染色。结果发现，模型组小鼠足底部皮肤组织（完全弗氏佐剂注射侧）相较于空白组存在明显的炎性浸润，豨红通络口服液低剂量和高剂量治疗组均有较好的改善。见图1。

表2 各组小鼠脚趾肿胀程度（x±s）Tab.2 Micetoe swelling（x±s）cm

图1 小鼠局部皮肤的HE染色Fig.1 HEstaining of local skin

2.3 豨红通络口服液对小鼠扭体抑制率的影响 为了观察豨红通络口服液对小鼠炎性镇痛的效果，选用腹腔注射醋酸。模型组相较于空白组出现了由醋酸诱导的小鼠扭体次数明显，而豨红通络口服液的低剂量、高剂量治疗组随着给药时间的增加，能够明显抑制小鼠的扭体次数，且高剂量治疗组治疗效果更加显著。见表3。

表3 各组小鼠扭体抑制率比较（x±s）Tab.3 Mice torsion inhibition rate（x±s）%

2.4 豨红通络口服液对脑卒中小鼠足底机械痛阈的影响 为了确证豨红通络口服液对神经病理性疼痛的改善效果，选用胶原酶诱发小鼠神经性疼痛模型，检测小鼠机械痛阈的情况。实验小鼠的机械痛阈在第1天到达谷值（模型组的痛阈下降至空白组的（43．55±8．57）%），在注入胶原酶之后除空白组其余各组机械痛阈下调明显，而通过豨红通络口服液的灌胃处理，随着给药时间的增加，治疗组的机械痛阈值有所回调，且高剂量治疗效果更佳（模型组的疼痛阈值下降至空白组的（54．83±5．85）%，而低剂量和高剂量治疗组则分别回调至空白组的（62．21±2．56）%与（65．26±3．74）%。见表 4。

表4 各组小鼠足底机械痛阈（x±s）Tab.4 Mechanical pain threshold of mice plantar（x±s）%

2.5 豨红通络口服液对脑卒中小鼠足底热痛阈的影响 为了观察豨红通络口服液对小鼠神经病理性疼痛的改善效果，选用胶原酶诱发小鼠神经性疼痛模型，检测小鼠足底热痛阈的情况。实验小鼠的足底热痛阈在第1天到达谷值 [模型组的热痛阈下降至空白组的（31．91±3．67）%]，在注入胶原酶之后除空白组其余各组足底热痛阈下调明显，而通过豨红通络口服液的灌胃处理，随着给药时间的增加，治疗组的足底热痛阈值回调明显，且高剂量治疗组治疗效果更佳[模型组的热痛阈下将至空白组的（51．83±5．86）%，而低剂量和高剂量治疗组分别回调至空白组的（70．02±7．35）%与（81．03±8．11%）]。见表 5。

表5 小鼠足底热痛阈表（x±s）Tab.5 The thermal pain threshold of mice plantar（x±s）%

2.6 豨红通络口服液对脑卒中小鼠脑神经细胞损伤的影响 为了观察豨红通络口服液对小鼠神经病理性疼痛的改善效果，选用胶原酶诱发小鼠神经性疼痛模型，通过检测小鼠神经细胞损伤的影响。如图2所示，从Nissl染色结果来看，空白组中的尼氏小体的着色深并且形状比较规整、数量较多，而模型组的尼氏小体着色较浅，形状变得不规整，并且数量较少，这说明小鼠注入胶原酶后，脑组织受到了损伤，且神经细胞也受到了一些损伤。低、高剂量豨红通络口服液治疗后，观察到脑组织中尼氏小体的着色增加，炎症得到很好的缓解。

图2 小鼠神经细胞Nissl染色图Fig.2 Nissl staining of mice nerve cells

2.7 豨红通络口服液对脑卒中小鼠脑小胶质细胞异常肥大的影响 为了观察豨红通络口服液对小鼠神经病理性疼痛的改善效果，选用胶原酶诱发小鼠神经性疼痛模型，检测小鼠脑胶质细胞的变化情况（多光谱定量）。如图3所示，实验模型组相比于空白组的胶质细胞的数量异常增多，并且形态变大、变厚，而本研究豨红通络口服液低剂量和高剂量治疗组相较于模型组都呈现出较小胶质细胞形态，并且数量也很少。光谱定量的结果空白组（100.00±2.25）%，模型组（144.53±22.05）%，低剂量治疗组（54.84±3.56）%，高剂量治疗组（127.27±10.54）%，与空白组的进行比较，模型组的胶质纤维酸性蛋白的表达显著性上调。进行豨红通络口服液治疗后胶质纤维酸性蛋白的表达显著性下调，且高剂量治疗组治疗效果更为明显。

图3 小鼠脑小胶质细胞免疫组化染色图Fig.3 Immunohistochemical staining of microglia cellsin mice

3 讨论

众所周知，疼痛特别是慢性疼痛（炎性、神经病理性疼痛）给患者带来的伤害是不言而喻的[13]。本实验通过化学刺激造模包括腹腔注射醋酸、足底注射CFA及耳廓涂抹二甲苯，诱导产生炎性疼痛，评价豨红通络口服液的外周镇痛效果；以及运用脑卒中造模探究豨红通络口服液的中枢性疼痛治疗作用。

研究结果发现富含川牛膝的复方制剂豨红通络口服液明显改善了二甲苯所致的耳廓炎性肿胀和CFA所致的脚趾肿胀。此结果与史玉芬等[4]在小鼠背部皮下注射牛膝具有改善巴豆油所致耳廓肿胀的抗炎效果一致，表明豨红通络口服液确有良好的抗炎作用。当然严重的炎性肿胀通常会伴随有异常的疼痛反应。而豨红通络口服液既明显缓解CFA所致的脚趾热痛阈下降，亦减轻了腹腔注射醋酸所致的扭体疼痛反应，进一步证实了豨红通络口服液具有抗炎镇痛之疗效。

基于豨红通络口服液对体表炎性肿胀及末梢炎性疼痛反应缓解的良好作用，进一步以脑卒中模型探究豨红通络口服液对中枢性神经病理性疼痛的治疗效果。通过对受试动物脑组织的神经细胞损伤及胶质细胞异常肥大的评估，结果发现豨红通络口服液不仅能减少脑卒中导致的脑组织中神经细胞损伤及胶质细胞异常肥大，亦缓解了脑损伤引起的痛觉敏化。此结果与秦秀德等[14]尾缘静脉注射红花注射液改善急性脑梗死实验大鼠神经功能的缺损，减轻炎症的报道相吻合，因为豨红通络口服液中也含有红花这一组分。由此可见适量的豨红通络口服液灌胃给药能发挥较好的抗炎镇痛作用，虽然其详细的镇痛机制和有效成分仍有待进一步的研究，但其确能改善末梢性的炎性疼痛反应，也能有效缓解中枢部位神经病理性疼痛，有助于指导临床针对慢性疼痛患者治疗的药物合理选用。

综上豨红通络口服液既能快速减轻起炎物质诱发的炎症肿胀和疼痛反应，也能改善脑卒中引起脑组织神经细胞受损及胶质细胞的异常肥大，有效缓解中枢性神经病理性疼痛，发挥良好的抗炎镇痛之功效。

参考文献：

[1] 郝羚竹，商慧娟．豨红通络口服液质量标准的研究[J]．中国药品标准，2012，13(4)：265-267．

[2] 杨志福，梅其炳，蒋永培．红花有效成分及药理作用[J]．西北药学杂志，2001，16(3)：131-133．

[3] 高昌琨，高 建，马如龙，等．牛膝总皂苷抗炎、镇痛和活血作用研究[J]．安徽医药，2003，7(4)：248-249．

[4] 史玉芬，郑延彬．牛膝抗炎、抗菌作用的研究[J]．中国中药杂志，1988，13(7)：44-47．

[5] 周万辉，曾英姿，王洪飞．快速通过血脑屏障的豨红通络口服液[P]．2012，CN．

[6]Tian GH，Tao SS，Chen MT，et al．Electroacupuncture treatment alleviates central poststroke pain by inhibiting brain neuronal apoptosisand aberrantastrocyteactivation[J]．Neural Plasticity，2016，2016:1437148．

[7] 谷 捷．二甲苯致小鼠耳肿胀急性炎症模型的建立[J]．湖南中医药大学学报，2016，36(5)：32-35．

[8] 苏小军．ERK通路抑制剂对完全弗氏佐剂致痛大鼠的镇痛效应及机制的研究[D]．北京:中国人民解放军军医进修学院，2006．

[9] 陶珊珊，李玉桑．六神丸含服对炎性和神经病理性疼痛的治疗作用[J]．绿色科技，2017，55(10)：211-214．

[10]叶和杨，熊小琴，邱 伟，等．瑞香素对醋酸、热板及电刺激致痛小鼠的镇痛作用[J]．中国组织工程研究，2005，9(22)：174-176．

[11]顾洪伟．小鼠原发性肝癌建模方法的优化[J]．中国实验动物学报，2016，24(1)：20-24．

[12]宁 丹．活血方提取物对GK大鼠糖尿病视网膜病变的保护机制[J]．中国临床药理学杂志，2016，32(23)：2178-2181．

[13]张文祥，倪家骧．慢性疼痛患者发生抑郁和焦虑症状的研究[J]．中国全科医学，2009，12(9)：775-777．

[14]秦秀德．红花注射液通过抗炎症反应治疗急性脑梗死的机制研究[J]．中国中医急症，2017，26(3)：409-411．