桑叶黄酮对吉富罗非鱼肌肉抗氧化指标及营养组成的影响

陈 冰，杨继华,2，曹俊明，黄燕华，孙育平，王国霞

(1.广东省农业科学院动物科学研究所，农业部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省动物育种与营养公共试验室，广东省畜禽育种与营养研究重点试验室，广州 510640；2.广东恒兴饲料实业股份有限公司，广东湛江 524094)

桑树在我国广泛种植，种植面积约100万公顷，桑叶的年产量高达1 000万吨，其含有多种营养成分和天然活性物质。黄酮类化合物是桑叶的主要功能性成分之一，占桑叶干物质的1%～3%[1]，具有抗肿瘤、降压、降血糖、抗氧化、抗衰老等生理功能[2]。一些研究发现，桑叶黄酮化合物能显著清除DPPH自由基，具有较强的抗氧化作用[3-4]。据报道，植物黄酮，如葛根总黄酮、槐属植物黄酮，可以改善动物生长性能、抗氧化能力及肉品质[5-6]。曲培滨[7]发现，桑叶黄酮对犊牛的生长、屠宰性能及肉品质的提高有良好的效果；李法见等[8]指出，桑叶对罗非鱼生长性能、脂质代谢和肌肉品质有促进作用。本实验室早期研究结果表明，饲料中添加桑叶黄酮能够显著提高吉富罗非鱼血清和肝脏抗氧化指标及抗亚硝酸盐应激能力[9]。目前，有关桑叶黄酮对水产动物肌肉抗氧化作用的研究未见报道。

罗非鱼是我国淡水养殖的主要品种，随着罗非鱼集约化养殖的发展，各种氧化应激因素不断增加，造成罗非鱼的抗氧化能力和抗病力下降。并且，抗生素类化学药物的不规范使用，严重影响肉品质及食用安全性。因此，利用天然植物生物活性物质提高鱼体的抗氧化性能，减少抗生素药物的使用，改善肌肉品质和安全性，对罗非鱼健康养殖具有重要意义。因此，本试验在前期关于生长性能和抗氧化能力研究[9]的基础上，进一步研究了在饲料中添加不同水平的桑叶黄酮对吉富罗非鱼(GIFT,Oreochromisniloticus)肌肉抗氧化性能和营养组成的影响,以便为桑叶黄酮在罗非鱼饲料中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验饲料

基础饲料配方及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加桑叶黄酮0、50、100、300、500、1 000 mg/kg(广东省农业科学院蚕业与农产品加工所提供，纯度77.9%)，配制6种试验饲料。配制饲料时，先将桑叶黄酮溶于水，再加入到各组饲料原料混合物中。各种原料经粉碎后过60目筛，称重后混匀，少量的成分采用逐级扩大法混合，用SLX-80型双螺杆挤压机(华南理工大学科技实业总厂生产)、G-500型造粒机(华南理工大学科技实业总厂生产)制成粒径为1.5 mm的颗粒饲料，55 ℃烘干，冷却后放入密封袋中于-20 ℃冰箱中保存备用。

表1 基础饲料配方及营养水平Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diet air-dry basis,%

注：1)每千克维生素预混料含有：VA 3 200 000 IU,VD31 600 000 IU,VE 16 g,VK 4 g,VB14 g,VB28 g,VB64.8 g,VB1216 mg,泛酸钙16 g,叶酸1.28 g,生物素64 mg,烟酸 28 g,肌醇 40 g。
2)每千克矿物质预混料含有：Mg 9 g,K 36 g,Met-Cu 1.5 g,Fe 10 g,Zn 8 g,Ca 230 g,Co 250 mg,Mn 1.9 g,I 32 mg,Se 50 mg。
3)营养水平为实测值。

1.2 试验鱼和饲养管理

试验吉富罗非鱼由广东罗非鱼良种场提供。在水泥暂养池驯养2周，期间投喂基础饲料。试验开始时，选取健康、活泼、初始体重为(1.51±0.02)g的吉富罗非鱼840尾，随机分为6组，每组4个重复，每个重复35尾鱼。饲养试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室室内循环水养殖系统中进行。系统由24个玻璃纤维桶和两个过滤池等部分组成，纤维桶容积均为350 L(直径90 cm，高80 cm，水体容积300 L)，养殖水源为经过活性炭、珊瑚石过滤后的自来水，流水速率为1.5 L/min，养殖过程中不断充氧曝气，溶氧>7.0 mg/L，pH 7.5～8.0，氨氮≤0.10 mg/L，亚硝酸盐≤0.01 mg/L，水温25～31 ℃。每天分别在8∶30和18∶00投喂1次，饱食投喂。试验时间为2015年8月29日—2015年10月23日，共56 d。

1.3 样本采集

饲养试验结束后，鱼体饥饿24 h，每个重复取16尾鱼，冰盘上解剖取其背肌，其中6尾用于测定抗氧化指标，4尾用于测定滴水损失、肌肉胶原蛋白，6尾用于测定肌肉常规成分和氨基酸组成，样品混合后于-80 ℃冰箱保存。

肌肉上清液制备：称取一定质量的肌肉样品，加9倍体积的0.80%预冷生理盐水，在冰水浴中进行匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，于-20 ℃冰箱保存，用于测定肝脏抗氧化指标。

1.4 指标测定

1.4.1 抗氧化指标

肌肉上清液用试剂盒进行抗氧化指标测定，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，具体测定方法参照试剂盒所附说明书。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用羟胺法测定，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用可见光法测定，总抗氧化能力(T-AOC)采用比色法测定，丙二醛(MDA)含量采用2-硫代巴比妥酸(TBA)法测定。

1.4.2 营养指标

肌肉常规成分测定：粗蛋白含量采用凯氏定氮法(GB/T6432-1994)、粗脂肪含量采用乙醚抽提法(GB/T6433-1994)、粗灰分含量采用550 ℃灼烧法(GB/T6438-1992)、水分含量采用冷冻干燥法(GB/T6435-1986)。

肌肉中胶原蛋白(羟脯氨酸)含量：羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中比例极少，其它蛋白中不存在。羟脯氨酸在氧化剂作用下产生的氧化物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其深浅可以推算出其含量。具体方法见南京建成生物工程研究所羟脯氨酸测定试剂盒说明书。

肌肉氨基酸：鱼的背肌冷冻干燥(德国 CHRIST 公司)后粉碎。采用6 mol/LHCl水解法，用安捷伦液相色谱仪(Agilent Technologies 1260 Infinity)衍生法测定。分析柱：安捷伦ZORBAX氨基酸分析柱，检测波长：254 nm,柱温：38 ℃，流速：1 mL/min。

1.5 数据处理

试验结果采用平均值±标准差(mean±SD,n=4)表示。采用 SPSS20统计软件中 One-wayANOVA方差分析和 Duncan，s 均值多重比较法对试验结果的差异显著性进行分析处理，P<0.05表示差异性显著。

2 结果分析

2.1 6组吉富罗非鱼肌肉的抗氧化指标

各组吉富罗非鱼肌肉SOD、GSH-Px、CAT活性、T-AOC及MDA含量见表2。100、300 mg/kg组肌肉SOD活性显著高于其他组。肌肉GSH-Px、CAT活性各组间差异不显著。500 mg/kg组肌肉T-AOC显著高于对照组和1 000 mg/kg组，与其他组差异不显著。肌肉MDA含量以50 mg/kg组最低，显著低于对照组，但与其他组间差异不显著。

表2 桑叶黄酮对吉富罗非鱼肌肉中抗氧化指标的影响Tab.2 Effects of mulberry leaf flavonoids on antioxidant indices in muscle of O.niloticus

注：表中同行数据后上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同行数据后未标注字母表示无显著差异(P>0.05)。下同。

2.2 6组吉富罗非鱼肌肉的常规营养成分

如表3所示，吉富罗非鱼肌肉的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分含量组间差异不显著，其中50～500 mg/kg组粗蛋白含量高于对照组。添加组粗脂肪含量均高于对照组，但没有显著差异。

表3 桑叶黄酮对吉富罗非鱼肌肉常规营养成分的影响Tab.3 Effects of mulberry leaf flavonoids on nutrients composition in muscle of O.niloticus %,wet matter

2.3 6组吉富罗非鱼肌肉的胶原蛋白含量

如表4所示，500 mg/kg组的胶原蛋白最高，显著高于其他组，其他添加组胶原蛋白含量均比对照组高，但差异不显著。

表4 桑叶黄酮对吉富罗非鱼肌肉胶原蛋白含量的影响(湿重)Tab.4 Effects of mulberry leaf flavonoids on collagen contents of O.niloticus(wet matter)

2.4 6组吉富罗非鱼肌肉的氨基酸组成

由表5可知。50 mg/kg组肌肉所检测的赖氨酸含量显著高于对照组。100 mg/kg组肌肉丙氨酸含量显著高于对照组。300 mg/kg组肌肉亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酸含量显著高于对照组。500 mg/kg组所检测的15种肌肉氨基酸含量与对照组相比没有显著差异。1 000 mg/kg组肌肉组氨酸含量显著高于对照组。添加组的必需氨基酸总量均高于对照组，但差异不显著。100～1 000 mg/kg组风味氨基酸含量高于对照组，但差异不显著。

表5 桑叶黄酮对吉富罗非鱼肌肉氨基酸组成的影响Tab.5 Effects of mulberry leaf flavonoids on muscle amino acids composition of O.niloticus %,dry matter

注：色氨酸未检测。标注*为风味氨基酸.

3 讨论

3.1 桑叶黄酮对吉富罗非鱼肌肉抗氧化指标的影响

活性氧(ROS)是细胞信号传导、基因表达、细胞增殖调控的胞内信使，而过多的活性氧会导致氧化应激，引起组织细胞内脂质过氧化[10-11]。活性氧在屠宰后的肌肉继续进行反应，产生过氧化物质而影响肉质。有研究表明，可通过在饲料中添加抗氧化剂以增强肌肉抗氧化能力，因屠宰后肌肉SOD活性越高、MDA含量越低的肌肉，其系水力越高、肉色越好，即肉质较好[12-13]。在鱼饲料中添加适量抗氧化剂(VE)能抑制肌肉中脂肪的过氧化，降低肌肉MDA含量，改善肌肉品质[14]。本试验中，桑叶黄酮能显著提高肌肉SOD活性、T-AOC，降低MDA含量。这与本实验室前期研究中桑叶黄酮显著提高罗非鱼血清和肝脏抗氧化指标的结果类似[9]。这表明桑叶黄酮能够提高罗非鱼的抗氧化性能，改善肌肉品质。宋琼莉等[15]研究发现，桑叶粉能显著提高肌肉中SOD的活性，降低肌肉中MDA的含量，有效提高肌肉的抗氧化能力。根据以上研究结果推测，桑叶黄酮可能是存在桑叶中提高肌肉抗氧化能力的活性物质之一。

3.2 桑叶黄酮对吉富罗非鱼营养组成的影响

鱼类的营养价值与肌肉粗蛋白含量密切相关，肌肉粗脂肪含量也会影响肌肉嫩度[16]。鱼类肌肉的营养成分主要受基因的影响，也受生长环境、养殖方式、生长阶段等因素影响。人工养殖条件下的水产动物肉品质很大程度上由饲料的质量决定，饲料的营养水平会影响养殖水产动物肌肉蛋白质、脂肪、氨基酸和一些风味物质的含量[17]。本试验中，桑叶黄酮提高了吉富罗非鱼肌肉粗蛋白含量，但影响不显著，对粗脂肪含量也没有显著影响。有研究表明，一些黄酮类化合物可以促进动物生长激素生成和释放[18],从而加快细胞的蛋白质合成，减少蛋白质的降解[19]。这表明桑叶黄酮中可能含有能促进动物生长激素生成和释放黄酮类化合物。有研究发现，苜蓿黄酮对崇仁麻鸡母雏胸肌和腿肌的蛋白质含量没有影响，但降低了腿肌脂肪的沉积[20]，本实验结果与这一报道有不一致的地方，究其原因可能是桑叶黄酮种类多样、结构丰富，禽类动物与水产动物生物学特性不同导致。

鱼类肌肉中的胶原蛋白具有保持鱼类肌肉完整性和韧性的作用，在一定程度上决定了肌肉的系水力和嫩度，在肌肉结构和品质等方面有重要作用[21]，罗非鱼、草鱼摄食蚕豆后肌肉胶原蛋白含量显著提高，失水率降低，鱼肉品质得到改善[16]。本实验中，500 mg/kg桑叶黄酮添加组的罗非鱼肌肉胶原蛋白含量较对照组显著增加。其作用机制可能是黄酮类化合物可以促进动物生长激素生成和释放[18]，而生长激素能提高肌肉、皮肤等组织中胶原蛋白含量[22-23]。这有待进一步研究证明。

肌肉蛋白质的营养价值和质量取决于蛋白质的氨基酸组成和消化率等因素[24]。氨基酸组成和含量是肌肉品质研究的关键指标之一，肉的鲜味在一定程度上与一些游离的风味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸)的含量有关，其中天冬氨酸和谷氨酸是呈鲜味的氨基酸，甘氨酸和丙氨酸是呈甘味的氨基酸。游离氨基酸不仅本身能够呈现出一定的味道，且在肌肉热加工过程中，游离氨基酸会与糖类发生美拉德反应，产生大量的不同气味的物质，这些物质决定了鱼肉多样性的风味[25-26]。研究发现，肌肉营养成分与饲料组成密切相关，桑叶能够提高肉羊肌肉呈味氨基酸含量的水平[27]。在肉羊日粮中添加沙葱黄酮后，羊肉总氨基酸和必需氨基酸的含量上升，天冬氨酸和谷氨酸含量均髙于对照组，说明沙葱黄酮可以提高肉的鲜味[28]。本研究发现，添加桑叶黄酮提高了肌肉丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酸含量。本实验室先前研究结果显示，适量的桑叶黄酮能提高罗非鱼的增重[9]。由此可知，桑叶黄酮在促进罗非鱼生长同时也能改善肌肉氨基酸组成。肌肉中风味氨基酸和必需氨基酸的含量一定程度上能提高肌肉风味和品质。桑叶黄酮对罗非鱼肌肉风味氨基酸含量及必需氨基酸含量有一定提高作用，但不明显。而其他植物来源的黄酮可以显著提高动物肌肉必需氨基酸和风味氨基酸。黄酮类化合物在不同类型动物体内作用的机制不同可能导致了这一现象的出现。

4 结论

添加适量的桑叶黄酮能够提高吉富罗非鱼肌肉抗氧化能力、胶原蛋白含量，改善肌肉营养组成。综合肌肉抗氧化性能、胶原蛋白含量和氨基酸组成的指标来评价，桑叶黄酮添加水平在300～500 mg/kg时效果较好。

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