集胞藻PCC 6803高产精氨酸藻株的紫外诱变选育

戢水玲 高 宏

(1. 中国科学院水生生物研究所， 中国科学院藻类生物学重点实验室， 武汉 430072； 2. 中国科学院大学， 北京 100049)

精氨酸是尿素循环的重要中间代谢物， 在医药和食品工业上具有广泛用途:它是复方氨基酸输液的主要成分之一， 是氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能的促进剂， 对病毒性肝炎疗效显著， 它还经常用作饲料、食品等的添加剂。

紫外(Ultraviolet， UV)诱变育种， 是利用波长为254 nm的紫外线能引起DNA结构发生改变形成嘧啶二聚体， 尤其是胸腺嘧啶二聚体这一特点， 引起微生物遗传性状发生改变， 然后通过抗性药物筛选出少数性状优良的突变株的过程[1]。之前报道用来精氨酸诱变育种的菌株主要有谷氨酸棒状杆菌、钝齿棒状杆菌、枯草芽孢杆菌和黄色短杆菌， 所使用的抗性标记物主要有D-精氨酸、L-刀豆氨酸、6-氮尿嘧啶、磺胺胍和精氨酸氧肟酸等[2]。然而这些菌株利用的氮源主要为有机氮源， 如: 牛肉膏、蛋白胨、酵母粗提物等。

集胞藻PCC 6803是单细胞蓝藻， 能进行光合自养生长， 也能利用葡萄糖进行混养、异养生长[3]， 可利用硝酸盐和亚硝酸盐作为氮源， 合成自己所需的氨基酸等化合物[4]。在工业生产所释放的烟气中，氮氧化物(NOx)是造成酸雨、雾霾的元凶[5]。然而NOx可与水反应形成硝酸根和亚硝酸根， 被蓝藻利用。因此可以在集胞藻PCC 6803中选育高产精氨酸同时去除NOx的藻株。

在精氨酸诱变育种的抗性标记物中， D-精氨酸、L-刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸都是L-精氨酸的类似物， 而6-氮尿嘧啶是嘧啶碱基的类似物。在细胞内L-精氨酸对自身合成途径中的关键酶N-乙酰谷氨酸激酶有着反馈抑制作用[6]， 通过筛选抗L-精氨酸类似物的突变株， 可以获得L-精氨酸反馈抑制减弱的突变株， 从而使细胞能大量积累精氨酸。氨甲酰磷酸是合成精氨酸和嘧啶的前体物， 受精氨酸和嘧啶碱基的积累阻遏， 当二者存其一时， 发生部分阻遏； 当二者共存时， 几乎发生完全阻遏， 因此选育6-氮尿嘧啶抗性有利于氨甲酰磷酸的积累， 从而有利于精氨酸的合成[7]。基于此， 本研究选择D-精氨酸和6-氮尿嘧啶作为紫外诱变的抗性标记物， 试图在集胞藻PCC 6803中选育将硝酸盐转化为精氨酸的藻株， 将来可用于去除工业废气中的NOx。

1 材料与方法

1.1 藻株和培养条件

集胞藻PCC 6803野生型(wild type， wt)是由北京大学赵进东教授赠送， 集胞藻#13807是分泌精氨酸突变株。除初筛和复筛时培养基中NaNO3浓度为12 g/L外， 藻株的培养条件均为30℃、30 μE/(m2.s)持续光照下BG11培养基混养(1 g/L葡萄糖)培养。

1.2 藻株的紫外诱变

藻株紫外诱变的方法参考Meireles和Tillich的报道[8，9]。具体方法为: 用254 nm波长的紫外光辐射对数期(A730=0.8)的细胞， 辐射一定时间后立即关掉紫外灯。接着在红光(632 nm， 避免光修复[10])下用没有任何抗性的BG11洗涤藻细胞一次， 1.5 mL培养基重悬后， 涂布在铺了NC膜的没有任何抗性的平板上。将所有平板用锡箔纸包住后在黑暗下放置1d后转移NC膜到添加了相应抗性标记物的平板上， 30℃、30 μE/(m2.s)持续光照培养7—10d， 长出单藻落后划线， 用来后续实验。

选择最佳诱变时间的方法是: 每个辐射时间点取500 μL藻细胞稀释10–4后取200 μL涂布平板， 将所有平板用锡箔纸包住后在黑暗下放置1d， 之后在30℃、30 μE/(m2.s)持续光照下培养7—10d， 待长出单藻落后统计藻落数目， 计算致死率。假设某个辐射时间点的藻落数为n， 未经辐射的藻落数为m， 则:致死率=(m–n)/m×100%。取致死率约为85%对应的辐射时间为最佳诱变时间。

选择抗性标记物临界浓度的方法是: 取对数期的藻细胞在含有不同浓度梯度的抗性标记物培养基中培养， 每个浓度梯度设4个平行， 初始接种A730≈0.05， 培养4d后测OD730。以添加抗性标记物作为实验组， 以不加作为对照组， 计算存活率。存活率=实验组A730/对照组A730×100%。取存活率约为3%对应的浓度为抗性标记物临界浓度。

1.3 藻株游离氨基酸的提取

胞外游离氨基酸的提取方法为: 藻细胞经4500×g离心后收集上清液并经0.45 μm过滤器过滤后收集滤液部分用作细胞外游离氨基酸的分析。胞内游离氨基酸的提取参考文献[11]略有改动: 将离心后的藻细胞先用无菌水洗涤2次， 然后用80%的乙醇重悬， 于65℃水浴抽提3h后离心取上清， 经0.45 μm过滤器过滤后滤液部分用作胞内游离氨基酸分析。

1.4 比色法检测精氨酸浓度

初筛采用比色法检测精氨酸浓度[12]， 其方法是: 在Eppendorf管中依次加入40 g/L NaOH溶液、80 g/L甲萘酚正丙醇溶液和0.5 mL/L双乙酰正丙醇溶液各300 μL， 再加入300 μL的待测样品。震荡摇匀后， 在30℃水浴15min后检测OD540值， 根据标准曲线换算成精氨酸浓度， 计算每OD730值细胞总精氨酸产量， 据此来评价藻株的产酸能力。每OD730值细胞总精氨酸产量=(胞内精氨酸浓度+胞外精氨酸浓度)/A730。

1.5 高效液相色谱(HPLC)分析精氨酸浓度

复筛采用HPLC检测精氨酸浓度， 其方法参考文献[13， 14]， 具体方法如下:

高效液相色谱仪是岛津LC-20A型， 由两台LC-20A高压泵， RF-10AXL荧光检测器， CAPLUGS RC-11型注射进样阀， CTO-20A柱恒温箱， CBM-20A系统控制器组成。色谱柱为安捷伦Zorbax Eclipse-AAA色谱柱(Agilent， USA)， 150 mm×4.6 mm， 粒径3.5 μm。流动相A: 40 mmol/L Na2HPO4pH 7.8； 流动相B∶乙腈∶甲醇∶H2O (45∶45∶10v∶v∶v)。

色谱仪工作程序设置的总流量为2 mL/min， 运行时间时26min。0—1.9min， B%(流动相B流速的比例)为0； 1.9—18.1min， B%从0—57%；18.1—18.6min， B%从57%—100%； 18.6—22.3min，B%保持100%； 22.3—23.2min， B%从100%—0；23.2—26min， B%保持为0。检测器的设置为0—16.8min， 激发光/发射光=340/450 nm； 16.8—26min， 激发光/发射光= 266/305 nm。柱温箱设置温度为40℃。

分析过程: 取待测样品15 μL加入到75 μL的硼酸盐缓冲液(pH 10.2)中， 振荡混匀； 之后加入15 μL的邻苯二甲醛衍生试剂(邻苯二甲醛和3-巯基丙酸各10 mg/mL)， 振荡混匀； 再加入15 μL的2.5 mg/mL 9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂， 振荡混匀后加入960 μL的H2O充分混匀后， 经0.45 μm过滤器过滤后用注射器吸取50 μL手动进样检测。

1.6 野生型及其突变株的生长曲线

取对数期的细胞接种到50 mL无任何抗性的BG11培养基中， 在30℃、30 μE/(m2.s)持续光照条件下振荡(100 r/min)混养培养， 藻细胞的初始接种浓度OD730为0.05。每个藻株作3个平行试验， 每天定时取样测OD730， 绘制生长曲线。

1.7 数据处理

数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0进行统计分析、作图等。

2 结果

2.1 筛选抗D-精氨酸突变株的结果

作者以集胞藻#13807为紫外诱变出发株， 检测了不同辐射时间的致死率， 发现10—30s致死率急剧增加， 其中20—30s致死率为70%—90%， 40s以后藻细胞全部死亡。由于过高的致死率会导致藻株变异幅度大， 产生较多负突变株， 而太低的致死率又很难达到诱变效果， 因此选择合适的诱变剂量，对获得最佳的诱变效果极为重要。一般来说， 选择致死率在75%—85%之间的诱变剂量较合适， 因此本研究选取25s作为集胞藻#13807的最佳诱变时间。

检测集胞藻#13807耐受D-精氨酸的临界浓度，如图 1所示， 在D-精氨酸为0.6 g/L时藻细胞的存活率仅为5%， 表明此浓度的D-精氨酸已经完全抑制了藻细胞的生长。当提高D-精氨酸浓度至0.8 g/L时藻细胞的存活率仅为3%， 因此本研究选择0.8 g/L作为集胞藻#13807耐受D-精氨酸的临界浓度。

图 1 集胞藻#13807在不同浓度D-精氨酸培养条件下的存活率Fig. 1 The effect of different D-arginine concentrations on the survival rate of #13807

对集胞藻#13807经紫外诱变得到的突变子先在含有0.8 g/L D-精氨酸的固体平板上划线， 然后接种到含0.8 g/L D-精氨酸的液体培养基中培养， 经固体、液体培养基两步抗性筛选后共得到173株用来初筛。对这173株突变株用比色法检测每OD730值细胞总精氨酸产量后， 选取了14株总精氨酸产量提高10倍左右的藻株进行复筛， 经过HPLC分析选取了产量最高的4株做了3次平行实验， 如图 2所示，#13807-111是精氨酸产量显著提高的突变株， 其每OD730值细胞总精氨酸产量相比出发株提高了2.4倍。

2.2 筛选抗6-氮尿嘧啶突变株的结果

为了进一步提高精氨酸产量， 作者对#13807-111进行了第二轮紫外诱变。首先检测了该藻株不同辐射时间的致死率， 结果发现在辐射时间仅为10s时致死率已经达到了80%， 而到15s的时候藻细胞就全部死亡， 因此选择10s作为第二轮的最佳诱变时间。

图 2 集胞藻#13807及其突变株每OD730值细胞总精氨酸产量Fig. 2 Total arginine production per OD730 of #13807 and its mutants

检测#13807-111耐受6-氮尿嘧啶的临界浓度，如图 3所示， 当6-氮尿嘧啶浓度为0.2 g/L时， 藻细胞存活率仅为4%， 表明此浓度的6-氮尿嘧啶已经完全抑制了藻细胞的生长， 因此本轮诱变选择0.2 g/L作为#13807-111耐受6-氮尿嘧啶的临界浓度。

图 3 #13807-111在不同浓度6-氮尿嘧啶培养条件下的存活率Fig. 3 The effect of 6-azauracil on the survival rate of #13807-111

对#13807-111经紫外诱变得到的突变子先在含有0.8 g/L D-精氨酸和0.2 g/L 6-氮尿嘧啶的固体平板上划线， 然后接种到含0.8 g/L D-精氨酸和0.2 g/L 6-氮尿嘧啶的液体培养基中培养， 经固体、液体培养基两步抗性筛选后共得到118株用来初筛。对这118株突变株用比色法检测每OD730值细胞总精氨酸产量后选取了14株产量提高3倍左右的藻株进行复筛， 经HPLC分析获得了一株精氨产量有所提高的突变株#13807-111-55。

对野生型、#13807-111和#13807-111-55绘制了生长曲线， 如图 4所示， 结果表明突变株和野生型的生长速率没有显著差别(P＞0.05)。

将出发藻株和两轮诱变得到的突变株同批次培养， 保证培养条件一致: 所有的藻株都在NaNO3为12 g/L、葡萄糖1 g/L的BG11培养基中混养培养10d后HPLC检测胞内、胞外精氨酸产量， 结果如图5所示， 每OD730值细胞， 集胞藻#13807和它的突变株胞内精氨酸产量差异不显著(P＞0.05)且都很低，然而它们的胞外精氨酸产量却有显著差别(P＜0.05):#13807-111和#13807-111-55的每OD730值细胞胞外精氨酸产量相比#13807分别提高了47.8倍和62.3倍，这表明本研究选育的抗D-精氨酸突变株#13807-111和抗D-精氨酸和6-氮尿嘧啶突变株#13807-111-55都是分泌精氨酸突变株。这两株藻中， 对于每OD730值细胞， #13807-111的总精氨酸产量相比出发株集胞藻#13807有显著提高(P＜0.05)， 而#13807-111-55的总精氨酸产量相比#13807-111只有略微提升(P＞0.05)， 表明筛选D-精氨酸抗性更有利于提高精氨酸产量， 而6-氮尿嘧啶抗性对提高精氨酸产量影响很小。虽然如此， 通过两轮紫外诱变筛选抗D-精氨酸和6-氮尿嘧啶的突变株， 作者选育到了每OD730值细胞胞外精氨酸产量提高62.3倍， 总精氨酸产量提高6.0倍的藻株#13807-111-55， 该藻株是一株分泌精氨酸突变株， 每OD730值细胞的胞外和总精氨酸产量分别达到(0.76±0.1) mg/(L.OD730)和(0.82±0.08) mg/(L.OD730)。

图 4 野生型和突变株在30℃、30 μE/(m2.s)混养条件下生长曲线Fig. 4 Growth curves of the wild-type and mutants at 30℃ and 30 μE/(m2.s) under mixotrophic growth conditions

图 5 集胞藻#13807及其突变株每OD730值细胞精氨酸产量Fig. 5 Arginine production per OD730 of #13807 and its mutants

3 讨论

#13807-111是集胞藻#13807经紫外辐射25s得到的突变株， 然而检测该藻株不同辐射时间的致死率， 发现在辐射时间仅为10s时致死率已经达到了80%， 而到15s的时候藻细胞就全部死亡， 造成这一结果的可能原因是紫外诱变对#13807-111某些基因或者位点造成了损伤， 使得它对紫外辐射更加敏感了， 在很小剂量的紫外辐射条件下都有可能造成藻细胞死亡。这提示我们在多次紫外诱变过程中，需要对每次的出发株测试致死率， 从而确定最佳的诱变时间。

D-精氨酸是L-精氨酸的类似物， 通过筛选抗D-精氨酸的藻株可以选育到精氨酸反馈抑制减弱的突变株， 从而提高精氨酸产量。本研究第一轮诱变通过筛选抗D-精氨酸突变株选育到了精氨酸产量显著提高的突变株#13807-111， 其每OD730值细胞总精氨酸产量相比出发株提高了6.0倍， 表明在蓝藻中筛选D-精氨酸抗性能够显著提高精氨酸产量。此外该藻株和#13807-111-55的精氨酸主要分泌到了胞外， 表明这两株突变株都是分泌精氨酸突变株，这可能是因为紫外诱变造成的突变不仅减弱了L-精氨酸的反馈抑制使得总精氨酸产量提高， 而且也改变了细胞膜的通透性使精氨酸分泌到胞外。

6-氮尿嘧啶是嘧啶碱基的类似物， 而嘧啶碱基阻遏氨甲酰磷酸的合成从而影响精氨酸的合成[7]，因此选育6-氮尿嘧啶抗性有利于精氨酸的合成。之前有报道称在枯草芽孢杆菌中， Kato等[15]利用亚硝基胍诱变， 选育到了耐受0.1 g/L 6-氮尿嘧啶的突变株AAr-9， 它的精氨酸产量相比出发菌株提高了1.7倍， 达到28 g/L。在本研究中， 利用D-精氨酸抗性选育到了精氨酸产量显著提高的藻株， 而利用6-氮尿嘧啶抗性选育却并没有成功。这可能是因为在枯草芽孢杆菌中， 通过选育6-氮尿嘧啶抗性来提高精氨酸产量的方法， 在蓝藻中不一定适用， 需要选择其他的抗性标记物来提高精氨酸产量。

1991年， Aruma等[16]对谷氨酸棒状杆菌进行NTG处理， 获得了一株精氨酸高产菌H-7096， 经离子交换柱可获得52.8 g/L的精氨酸粗结晶。2003年，苏令鸣等[17]以黄色短杆菌为出发株经NTG诱变和选育， 获得高产精氨酸菌株AN78， 在20 L发酵罐中培养4d， 产酸率可达61.1 g/L。本研究#13807-111-55是精氨酸产量显著提高的突变株， 其胞外和总的精氨酸产量分别为(3.19±0.72)、(3.44±0.65) mg/L，远远低于工业上精氨酸发酵菌的产量， 因此需要更多的研究来进一步提高蓝藻精氨酸产量。首先， 本研究选育抗6-氮尿嘧啶突变株并没有显著提高精氨酸产量， 因此可以通过选育抗其他药物， 例如抗精氨酸氧肟酸、抗磺胺胍、抗L-刀豆氨酸等的突变株来进一步提高精氨酸产量。其次， 由于#13807-111-55能利用葡萄糖异养生长， 因而可以通过不断优化培养条件， 达到高密度培养的目的， 提高精氨酸产量。第三， #13807-111-55是精氨酸分泌突变株， 能利用硝酸盐和亚硝酸盐合成精氨酸并分泌到培养液中， 便于精氨酸的提取纯化。因此#13807-111-55是一株潜在的用于生物脱硝同时分泌精氨酸的藻株。

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