Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化

2018-05-16张文举许馥慧邓志瑞

上海大学学报（自然科学版） 2018年2期

邱实,张文举, 许馥慧,邓志瑞

番茄(Solanum lycopersicum)作为重要的模式植物,其基因组大小为950 Mbp,共编码35 000个基因,遗传学背景较为清楚.Micro-Tom是一种番茄突变体,具有生命周期短、株型矮小,比普通番茄更适合用于遗传转化的特点[1-2].但与其他植物一样,Micro-Tom在遗传转化后往往出现愈伤组织和再生植株诱导频率下降的问题.这主要与所使用的遗传转化条件和植株再生体系有关.

有研究表明,外植体的选用对于愈伤组织诱导和植株再生有较大的差异.卡那霉素常被用来筛选转基因阳性候选植株,但过高浓度的卡那霉素也会对候选植株的生长造成影响.不同的外植体所适用的浓度有所不同[3],一般用量为100∼200 mg/L[4].在遗传转化体系中,往往选用羧苄青霉素或头孢霉素作为抑菌抗生素,用于抑制多余农杆菌和杂菌的生长,但因用量较大,在一定程度上也会抑制外植体的生长[5].替门汀作为相对较新的抑菌抗生素,其抑菌应用在选择培养过程中还处于早期尝试阶段.

本实验选用番茄Micro-Tom的子叶和下胚轴作为外植体,以愈伤组织发生和不定芽的生长作为指标,对植物激素配比、预培养时间、共培养时间、抗生素浓度等参数进行了探索,初步建立了番茄Micro-Tom的遗传转化体系,为后续的遗传转化研究奠定了基础.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

外植体来源与选择.首先将Micro-Tom种子(PanAmerican Seed公司)依次用75%乙醇、20%次氯酸钠和无菌水进行灭菌处理,然后将种子置于种子萌发培养基(1/2MS+3%蔗糖+0.2%植物凝胶)中进行培养.1周后种子萌发并生长到子叶期.选取幼苗子叶和下胚轴,分别切成0.5 cm2的叶盘和0.5 cm的茎段,置于预培养基中,使切口接触培养基.

菌种、质粒与引物.用于转化的农杆菌株为ATHV(KWS种子公司),载体质粒为含抗卡那霉素的nptⅡ基因pGPTV-ESK1i(KWS种子公司).根据载体质粒的外源DNA片段(同一片段正向和反向插入在不同的位置)序列设计了用于鉴定转基因阳性植株的一对引物(由上海生工生物工程公司合成).正向引物p RNAintroF序列为5’-GGAAAATGTCGTGTTGTGGTC-3’;反向引物p RNAiterR序列为5’-CCTGCAGGTCACTGGATT-3’.两个引物间的片段长度为720 bp,如果其聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物长度为720 bp,就说明携带外源基因的质粒进入了植物组织.

培养基的制备.MS培养基、1/2MS培养基购自于Phyto Technology公司;蔗糖、植物凝胶、吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)、玉米素(zeatin,ZT)、卡那霉素、替门汀等均购自于上海生工生物工程公司.激素和抗生素采用过滤灭菌,在培养基灭菌后且未冷却时加入.预培养基、共培养基、选择培养基、生根培养基的基本组分均为MS+3%蔗糖+0.2%植物凝胶.

农杆菌的制备与侵染.将携带表达载体质粒的农杆菌单菌落置于YEB培养基中,28°C黑暗条件下震荡培养.OD600=1.0时收集菌体,悬浮于MS培养基中.侵染预培养后的外植体10 min,并用无菌滤纸吸去外植体表面的多余菌液.将侵染后的外植体置于共培养基上,28°C避光培养.

转基因植株的鉴定.DNA提取使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程公司),PCR反应使用即用型PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程公司).

1.2 实验方法

1.2.1 ZT浓度对愈伤组织发生和不定芽生长的影响

选取IAA作为组织培养的生长素,ZT作为细胞分裂素.培养基中保持IAA质量浓度为1.0 mg/L不变[6],同时加入不同浓度的ZT进行配比组合.将子叶和下胚轴外植体置于培养基中,在温度25°C,光照强度6 000 lx,光周期16 h条件下进行培养.对比不同ZT浓度下愈伤组织和不定芽的生长情况,确定适宜愈伤组织和不定芽诱导的ZT浓度.

1.2.2 不同外植体愈伤组织形成和再分化的差异

将子叶和下胚轴外植体置于MS培养基中,在温度25°C,光照强度6 000 lx,光周期16 h条件下进行培养.每14 d将外植体继代一次,连续培养6周.每天观察并记录生长情况.

1.2.3 预培养时间对外植体不定芽生长的影响

在温度25°C,光照强度6 000 lx,光周期16 h条件下培养子叶外植体.分别在培养0,3,5和7 d后用农杆菌侵染,然后共培养和选择培养.待出芽情况稳定后,统计出芽的外植体数量,计算不定芽诱导率.

1.2.4 共培养时间对外植体不定芽生长的影响

将5组经过侵染的子叶外植体分别共培养1,2,3,4和5 d.每天观察外植体生长及农杆菌污染情况,将未长出农杆菌菌苔的子叶外植体转移至选择培养基继续培养.待出芽情况稳定(大约14 d)后,统计出芽的外植体数量,计算不定芽诱导率.凡是共培养之后出现农杆菌的就认为是被污染,并计算污染率.

1.2.5 抗生素对愈伤组织发生和不定芽生长的影响

将外植体直接接种到含不同浓度卡那霉素的MS培养基上.待出芽情况稳定后,统计愈伤组织形成率和不定芽诱导率,确定番茄遗传转化中用于筛选阳性株的卡那霉素浓度.

将经过预培养、农杆菌侵染和共培养后的外植体,转至含不同浓度替门汀的MS培养基上,在温度25°C,光照强度6 000 lx,光周期16 h条件下进行培养.根据外植体不定芽诱导率,确定番茄遗传转化中用于抑菌的替门汀浓度.

1.2.6 再生植株的获得

根据1.2.1∼1.2.5节所确定的实验条件,待不定芽长成2∼3 cm的幼苗时,单独切下,转移至生根培养基(MS+1.0 mg/L IBA+3%蔗糖+0.2%植物凝胶)上,每个培养瓶放置1∼2株.取生根的幼苗,洗净根部的琼脂后,移栽于装有草炭、蛭石和珍珠岩(体积比为3∶1∶1)的花盆中,并在上面加盖保湿薄膜,保持3∼5 d,再逐渐揭去保湿薄膜,得到初步炼苗成功的番茄植株.将幼苗移至土壤中进行培养,直至生长稳定.

1.2.7 转基因阳性候选植株的鉴定

随机选择转基因阳性候选植株的叶片,按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA,并使用引物p RNAiterR和pRNAintroF进行PCR鉴定.PCR反应程序如下:首先94°C预变性5 min;然后以94°C变性30 s、55°C退火30 s、72°C延伸30 s为一个循环,共进行35个循环;最后72°C延伸10 min.

1.2.8 数据处理

愈伤组织形成率和不定芽诱导率的计算如式(1)和(2)所示.每组实验培养90个外植体,重复3次.显著性分析方法选用邓肯新复极差测验.

2 结果与分析

2.1 ZT浓度对愈伤组织发生和不定芽生长的影响

在不同的ZT浓度下,子叶和下胚轴诱导愈伤组织和不定芽的情况如表1所示.可以看出,子叶和下胚轴的愈伤组织诱导率随ZT浓度的增加而升高,但不定芽诱导率呈先升高后降低的趋势.这说明在一定浓度范围内,较高浓度的ZT有利于不定芽的分化,但ZT浓度过高对不定芽的诱导却产生了抑制作用.由表1可见,当ZT质量浓度在0.5 mg/L时,子叶和下胚轴的不定芽诱导率都是最高的,与0.2 mg/L ZT组和2.0 mg/L ZT组存在显著差异.结果表明,不定芽分化适宜的培养基激素配比为1.0 mg/L IAA+0.5 mg/L ZT.

表1 ZT浓度对愈伤组织形成和再分化的影响Table 1 Effects of ZT concentrations on callus formation and redifferentiation

2.2 不同外植体愈伤组织形成和再分化的差异

在同样条件下,子叶和下胚轴愈伤组织的形成和再分化有一定的差异(见表2),在愈伤组织和不定芽诱导以及生根所需时间上,前者都少于后者,分别为29和35 d(前者比后者少了近六分之一).根据表1和2的实验结果可以确定,子叶比下胚轴更适合作为遗传转化体系所使用的外植体.

表2 愈伤组织形成和再分化所需要的培养时间Table 2 Time needed for callus formation and redifferentiation d

2.3 预培养时间对不定芽生长的影响

表3为预培养天数对不定芽生长的影响.可见,预培养3 d的外植体不定芽诱导率明显高于预培养0,5和7 d,且分别是预培养0 d的2.7倍,以及预培养5,7 d的1.7倍.这说明不经过预培养或预培养时间过长均不利于不定芽的形成.因此,用于转化的外植体预培养的适宜时间为3 d.

表3 预培养时间对不定芽生长的影响Table 3 Effects of preculture time on adventitous bud growth

2.4 共培养时间对不定芽生长的影响

经过14 d的选择培养,外植体不定芽诱导率及农杆菌污染率如表4所示.可以看出:共培养2 d的外植体的不定芽诱导率最高,达26.3%,且没有出现农杆菌污染;共培养3 d或更长时间的外植体,从共培养的第3天起,子叶切口处就开始褐化,培养基出现农杆菌菌落,不定芽诱导率降低.分析该现象的原因,可能是由于过度生长的农杆菌严重影响了外植体的生长,导致不定芽诱导率快速下降.而当共培养少于2 d时,农杆菌对植物细胞不能有效转化,不定芽诱导率更低.根据上述结果,在遗传转化过程中,适宜的共培养时间为2 d.

表4 共培养时间对不定芽生长的影响Table 4 Effects of co-culture time on adventitous bud growth

2.5 抗生素对不定芽生长的影响

抗生素对不定芽生长影响的统计结果如表5和6所示,其中CK表示对照组.从表5可以看出:随着卡那霉素浓度的增加,子叶外植体的不定芽诱导率显著下降;当卡那霉素浓度达到40 mg/L时,子叶外植体生长停止,不定芽诱导率为0.根据上述结果,确定用于筛选抗性不定芽的卡那霉素浓度下限为40 mg/L.

表5 卡那霉素对不定芽生长的影响Table 5 Effects of kanamycin on adventitous bud growth

由表6可知,外植体的不定芽诱导率随替门汀浓度的增加呈先升高后降低的趋势.当替门汀浓度较低时,培养基会出现较为明显的农杆菌污染.随着替门汀浓度的增加,污染率逐渐降低.当浓度达到150 mg/L时,替门汀可以完全抑制农杆菌的生长,同时不定芽诱导率也最高.根据上述结果,确定遗传转化过程中用于抑菌目的的替门汀的适宜浓度为150 mg/L.

表6 替门汀对不定芽生长的影响Table 6 Effects of timentin on adventitous bud growth

2.6 再生植株的获得

图1 Micro-Tom番茄遗传转化的不同生长阶段Fig.1 Different growth stages of Micro-Tom tomato for genetic transformation

再生植株的获得经历了愈伤组织诱导、不定芽发生、生根、生根后的移栽和炼苗等多个过程,整个培养过程的典型结果如图1所示,其中种子萌发培养基组分为1/2MS+3%蔗糖+0.2%植物凝胶,预培养基和共培养基组分为MS+3%蔗糖+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/L IAA+0.2%植物凝胶,选择培养基组分为MS+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/L IAA+40 mg/L卡那霉素+150 mg/L替门汀+3%蔗糖+0.2%植物凝胶,生根培养基组分为MS+1.0 mg/L IBA+3%蔗糖+0.2%植物凝胶.

2.7 转基因阳性候选植株的鉴定

以T0转基因植株的总DNA为模板,用引物pRNAiterR和pRNAintroF进行PCR检测,结果如图2所示,其中1为空白对照,2为阳性对照,3∼10为T0转基因候选植株,M为DM5000 marker.可见,转基因阳性植株扩增出与阳性对照相同的720 bp的目的片段,未扩增出任何条带的为假阳性植株.根据上述结果,初步确定目的基因已整合到Micro-Tom番茄基因组中.

图2 T0转基因番茄目标基因的PCR检测Fig.2 PCR detection of target gene in T0 transgenic tomato

3 讨论

植物不同组织器官因分化程度和生理生化基础不同,其脱分化和再生潜能也有所区别.在番茄上已有用根、叶、花药、子叶和下胚轴进行离体培养获得再生植株的报道[7-8].有研究表明,由番茄花药等分化程度较高的组织培养形成愈伤组织的分化率不高,而利用根培养则对培养基中必需元素的要求非常严格[9].番茄的子叶和下胚轴作为外植体均能形成完整植株.虽然子叶、下胚轴的成苗明显优于其他外植体,但成苗的早晚和正常苗的比率有很大差异[10].本实验进一步比较了子叶和下胚轴作为番茄组织培养外植体的差异,发现在同样的激素配比条件下,子叶的不定芽诱导率高于下胚轴,并且子叶形成愈伤组织的时间、出芽时间和生根时间均少于下胚轴.

在组织培养过程中,外源植物激素的使用必不可少.许多学者对不同激素配比和浓度进行了实验,但因激素种类和配比差异较大,结果不尽一致.外植体分化芽的能力除了要求一定的激素浓度外,更取决于培养基中细胞分裂素和生长素的种类和比例.在番茄的再生体系研究中,最常见的细胞分裂素为ZT和6-苄基腺嘌呤(6-benzyl aminopurine,6-BA)[11].陈丽萍等[12]和欧阳波等[13]的研究表明,在番茄再生体系中,ZT的效果好于6-BA,其一般用量为0.1∼2.0 mg/L.番茄再生体系研究常选用IAA作为生长素,报道的用量为0.02∼4.00 mg/L[6].本实验主要研究了ZT作为细胞分裂素对番茄外植体生长的影响,确定了培养基中ZT和IAA的适宜质量浓度分别为0.5和1.0 mg/L.这与已有的激素配比[11]类似,但也有一定的差异.例如王傲雪等[11]认为,更高浓度的ZT(2.0 mg/L)和更低浓度的IAA(0.2 mg/L)有利于番茄外植体的不定芽再生,激素浓度的差异也可能是由于实验所用的番茄品系不同所引起的.

有些植物在转基因再生过程中不需要预培养.例如烟草和豇豆的叶片外植体不论是否经过预培养,其转化率均没有差异.有些植物的外植体在农杆菌侵染之前需要进行预培养,但对于预培养时间的长短,目前还没有定论,通常由基因型和外植体的种类来确定.以番茄叶片作为外植体时,其转化过程中一般需要进行2 d的预培养[14],预培养后的番茄叶片转化率高于未经预培养的叶片[15].本实验发现,在Micro-Tom的遗传转化过程中,预培养时间为3 d时对不定芽诱导最有利.这与之前报道的2 d时间有所差别,但比较接近.推测产生这种差异的原因是因为Micro-Tom与张赛群等[15]研究的番茄品种(A21等)不同.

遗传转化使用的载体质粒通常会携带某种抗生素抗性基因,以便于在遗传转化的选择培养阶段筛选到转化植株.培养基中的抗生素浓度对于筛选结果至关重要,既要保证杀灭非转化的外植体,又要保证对转化的材料没有明显的影响.因此,在进行遗传转化前有必要了解外植体对筛选抗生素的耐受能力,确定选择培养基中加入抗生素的最低浓度,从而实现杀死未成功转化的外植体并保留转基因外植体的目的.卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素,它通过与植物细胞器叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合,从而在翻译过程中干扰蛋白质的合成,导致植物细胞死亡.在筛选时,非转化的细胞因不含该抗性基因而被抑制或杀死,而转化细胞由于获得了抗性,可以在含一定浓度的卡那霉素培养基上存活下来[16].张丽华等[3]比较了B01,B02,B03,B04这4个加工番茄品种对卡那霉素的耐受能力.结果表明,筛选番茄子叶、下胚轴外植体的卡那霉素适宜浓度约为75 mg/L,并且子叶外植体相比下胚轴外植体对卡那霉素更为敏感.本实验结果也显示,Micro-Tom子叶外植体对卡那霉素更加敏感,当卡那霉素浓度为40 mg/L时,即可完全抑制Micro-Tom子叶外植体的生长.

在农杆菌介导的遗传转化中,常使用抑菌抗生素抑制转化后农杆菌的生长.因为共培养后,外植体的表面以及内部会残留农杆菌,容易发生污染,因此对于抑菌抗生素的选择,原则上要兼顾对农杆菌生长的有效抑制和对转化外植体再生的没有抑制.共培养之后,用于杀灭或抑制农杆菌的常用抗生素种类有羧苄青霉素(carbenecillin,Carb)、头孢霉素(cefotaxime,Cef)、替门汀等,其中Carb和Cef的应用最广泛.通常认为Cef可以抑制外植体的不定芽分化,Carb能抑制根的形成[17].替门汀是一种新型的有效抑制农杆菌的特效抗生素,其组分为替卡西林钠及克拉维酸钾,二者质量比为15∶1.克拉维酸钾单独抗菌时作用甚微,这是因为多种革兰氏阳性菌(G+)和阴性菌(G−)都能产生β-内酰胺酶,这类酶能在青霉素作用于病原体之前将其破坏.替卡西林钠是一种β-内酰胺酶不可逆性高效抑制剂,通过阻断β-内酰胺酶破坏细菌的防御屏障,恢复细菌对克拉维酸钾的敏感性.因此,克拉维酸钾与替卡西林钠配合使用使替门汀成为具有广谱杀菌作用的抗生素[18].替门汀在抑制农杆菌的同时,对于植物材料的影响很小,特别适合较难转化材料的转基因[19].Cheng等[20]的研究结果表明,替门汀在烟草遗传转化中的使用浓度一般为500 mg/L左右,但本实验结果表明,当替门汀浓度达到150 mg/L时即可完全抑制外植体表面的农杆菌生长.推测原因可能是Cheng等[20]研究中使用的农杆菌菌株LBA4404与本实验中的菌株AHTV对替门汀的敏感程度不同.