二苯甲酮对蛋白核小球藻的毒性研究

王海洋 许晓路 张德勇

（浙江树人大学生物与环境工程学院 浙江杭州 310015）

引言

二苯甲酮（Benzophenone，BP）具有抑制苯乙烯聚合、香料定香和紫外吸收等多种功能，长期以来作为紫外线吸收剂、有机颜料、医药、香料、薄膜涂层的光敏剂、杀虫剂的中间体被广泛应用于各个领域，并大量被排放到水体、土壤等环境介质中，甚至在各类生物体中也已检测到[1]。防晒霜、护肤液等个人护理品及食品包装袋等产品中的BP还可通过饮食、呼吸和皮肤接触等途径进入人体[2,3]。体外实验表明BP对内分泌系统有明显的干扰效应，并具有发育毒性等[4]。目前，关于水体中的BP对藻类的影响研究尚少，有许多问题亟待阐明。通过分析BP对蛋白核小球藻的毒性，可为BP污染生态风险评价提供依据，并为全面认识其对生态环境和人类健康的影响提供参考。同时，也可为研究此类污染物对其他生物的致毒机理提供参考，并为此类化学物质的使用管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 藻类染毒

配制含系列浓度BP的HB-4培养液，于三角瓶中培养蛋白核小球藻，初始浓度为7×105个/mL[5]。染毒实验中的BP染毒剂量如表1及表2所示。藻类培养方法为四层纱布封口，在25℃、12h/12h光照黑暗循环下培养八天，每组设三重复组。每天进行取样并分析藻类增殖速度，染毒实验完成后测叶绿素含量、各抗氧化酶活力、MDA含量等，利用SPSS软件的One-way ANOVA法分析不同组结果之间的差异显著性。

1.2 96h-EC50计算

蛋白核小球藻生物量用前期建立的光密度法进行计算，公式为y=0.0164x-0.0299。公式中y指A690值，x指藻类数量（×106个/mL）。根据计算出的96h后各组的细胞数量，计算BP对藻类生长的抑制率，并根据Jiang等的报道计算出96h-EC50值[6]。

1.3 叶绿素含量分析

将30mL藻液首先用微孔滤膜进行过滤，收集藻细胞，转移进研钵并加少许乙醇或研磨。然后离心，收集滤液并定容到10 mL，在4℃、避光环境中放置4h。上述提取液于3000g速度离心20min，将上清转移到比色管后用90%乙醇定容到10mL。将上清进行光度计分析，测量A665和A649值。计算公式为：叶绿素a（mg/L）=13.95A665-6.88A649；叶绿素 b（mg/L）=24.96A649-7.32A665。两者相加则得到总叶绿素的浓度。

1.4 抗氧化酶活力分析

将30mL藻液在4000g速度下离心15min，取沉淀并以PBS（pH7.8）重新悬浮，并用超声波法进行破碎。以5000g速度离心10min后收集上清，即为粗酶液。然后可分别测定超氧化歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及过氧化物酶（POD）活性。CAT、SOD活力根据Chen等的报道测定[7]。POD活力根据Bewley等的报道测定[8]。

1.5 丙二醛（MDA）含量分析

将30mL藻液用微孔滤膜过滤，收集藻体，然后加入10%TCA后研磨使藻细胞破碎，然后在5000g速度下离心10min，收集上清液，即为MDA液。然后移取2 ml该MDA提取液到试管，再加入2 mL的 0.6%硫代巴比妥酸，于沸水浴条件下处理10min，然后快速冷却。再进行4000g速度离心10min，上清液马上测吸光度值。计算公式为：MDA浓度=6.45（A532-A600）-0.56*A450[9]。

2 结果

2.1 96h-EC50值

经计算，BP对蛋白核小球藻的抑制率(P%)和浓度的自然对数(LnC)的线性回归方程：y=0.1117x+0.3455，R2=0.9947，其 96h-EC50值为3.98 mg/L。

2.2 叶绿素及MDA含量

如表1所示，当BP剂量╭2.6mg/L时，引起蛋白核小球藻中叶绿素a含量降低（p＜0.05）；当BP浓度╭3.9mg/L时，导致蛋白核小球藻中叶绿素b含量、总叶绿素含量均降低（p＜0.05）；当BP浓度╭2.6mg/L时，导致蛋白核小球藻中MDA含量上升（p＜0.05）。上述结果证实BP可影响蛋白核小球藻中的叶绿素含量与MDA含量。

表1 各组叶绿素含量及MDA含量

2.3 抗氧化酶的活性

如表2所示，当BP浓度╭6.5mg/L时，导致蛋白核小球藻中SOD活力下降（p＜0.05）；当BP浓度╭6.5 mg/L时，导致蛋白核小球藻中的CAT、POD活性均降低（p＜0.05）。

表2 各组抗氧化酶类活性

结语

本研究初步证实了BP对蛋白核小球藻的毒性效应，会降低藻类增殖速度。经过8天染毒后，BP暴露可导致蛋白核小球藻中的叶绿素含量降低、MDA含量升高及抗氧化酶类活性下降。上述效应主要在BP浓度达到3.9mg/L时开始出现。当BP染毒浓度达到7.8mg/L后，叶绿素a含量下降了约76%，叶绿素b含量下降了约54%，MDA浓度上升了73%左右，CAT活力下降了57%左右，POD活力下降了46%左右，SOD活力降低了71%左右，显示该浓度下的BP对藻类的生理代谢有显著干扰。

作为进行光合作用的场所和基本条件，叶绿素含量直接反映藻类代谢和增殖活力的情况。本研究中，当BP浓度达3.9mg/L时，无论叶绿素a还是叶绿素b均开始表现出数量的下降（p＜0.05），显示BP对藻类的毒性与光合作用有关，且效应与剂量大致呈正相关。本研究中测定的抗氧化酶类，其功能主要是通过清除细胞内的活性氧来帮助藻细胞维持平衡的氧代谢，以避免细胞膜的膜脂发生过氧化损伤。在本研究中，BP浓度达3.9mg/L时，对抗氧化酶活性的抑制作用普遍出现，且与剂量大致呈正相关。本研究中分析的MDA含量则是细胞膜质发生过氧化后产生的分子，是一种抗逆性分子，其含量可反映藻类的逆境伤害情况。MDA在藻类处于胁迫环境中时会增加含量以应对胁迫。本研究中当BP剂量达到3.9mg/L时，MDA浓度增高（p＜0.05），证实藻类发生了膜脂过氧化及细胞的损伤。总体看来，BP对淡水藻类有多方面的毒性效应，如果任由其大量排放，可能会对生态环境造成破坏，值得关注。

参考文献

[1]Balmer ME,et al.Occurrence of some organic UV filters in wastewater,in surface waters,and in fish from Swiss lakes[J].Environ Sci Technol,2005,39(4):953-62

[2]Blüthgen N,et al.Effects of the UV filter benzophenone-3(oxybenzone)at low concentrations in zebrafish(Danio rerio)[J].Toxicol Appl Pharm,2012,263(2):184-94.

[3]Sun HQ,et al.Acute toxicity and ecological risk assessment of benzophenone andn,n-diethyl-3 methylbenzamide in personal care products[J].Int J Environ Res Public Health,2016,13(9):925.

[4]Schlumpf M,et al.Endocrine activity and developmental toxicity of cosmetic UV filters-An update[J].Toxicology,2004,205 (1-2):113-22.

[5]沈韫芬等.微型生物监测新技术,北京:中国建筑工业出版社,1990,275-86.

[6]蒋亚林等.细胞生物学实验 [M],上海:复旦大学出版社,1996,16-17.

[7]Chen K,et al.2009.Effect of nitric oxide on N metabolism and Thylakoid membrane in Chlorella pyrenodosa response to UV-B radiation,Ecology and Environmental Sciences,2009,18:865-8.

[8]Bewley TD.1979.Physiological aspects of desiccation tolerance.Ann Rev Plant Physiol,1979,30:195-238.

[9]Srivastava OP,et al.Evidence for close association of POD polyphenol oxidase and IAA oxidase isoenzyme of peanut suspension culture medium.Can J Bot,1973,51:2207-15.