二元双水相体系对欧李种仁清蛋白及球蛋白的萃取

孙雁霞 时羽杰 罗倩 唐媛 田计均 邬晓勇

摘要：为研究二元双水相体系对欧李种仁清蛋白和球蛋白的萃取条件，采用（乙醇+丙酮）（二者体积比为1∶2）/硫酸铵构成的二元双水相体系，对欧李种仁的清蛋白和球蛋白分别进行萃取，通过比较2种蛋白在此二元双水相体系中的分配系数、回收率等特性，最终确定欧李种仁清蛋白和球蛋白的最佳萃取条件。实验结果表明：当二元双水相体系组成为27.5%（乙醇+丙酮）（二者体积比为1∶2）和26%硫酸铵时，清蛋白的分配系数最小，萃取率达到最大；当二元体系组成为17.5%（乙醇+丙酮）（二者体积比为1∶2）和24%硫酸铵时，球蛋白的分配系数最小，萃取率达到最大。二元双水相体系为分离清蛋白与球蛋白提供了新的途径，在植物来源的清蛋白与球蛋白提取中具有良好的应用前景。

关键词：生物工程其他学科； 二元双水相体系；萃取；球蛋白；清蛋白

中图分类号：O652.62；Q512+.1；Q512+.2文献标志码：A

Extraction of globulin and albumin from Cerasus humilis by

binary aqueous two-phase system

SUN Yanxia1，2， SHI Yujie1，2， LUO Qian1，2， TANG Yuan1，2， TIAN Jijun1，2， WU Xiaoyong1，2

（1.College of Pharmacy and Biological Engineering， Chengdu University， Chengdu， Sichuan 610106， China；2.The Ministry of Agriculture Key Laboratory of Cereal Processing， Chengdu， Sichuan 610106， China）

Abstract：In order to optimize the extraction conditions， an binary aqueous two-phase system （BATPS） composed of ethanol and acetone（volume ratio is 1∶2） and ammonium sulphate is selected to extract globulin and albumin from Cerasus humilis seeds. The distribution characteristic of the globulin and albumin in this aqueous two-phase system is reflected by comparing critical data such as partition coefficient and recovery rate. The experiment shows that the optimum conditions of albumin is composed of 27.5% ethanol and acetone （volume ratio is 1∶2）， and 26% ammonium sulphate， the optimum conditions of globulin is composed of 17.5% ethanol and acetone（volume ratio is 1∶2）， and 24% ammonium sulphate. These results suggest that the BATPS is efficient in extracting albumin and globulin with bright application prospect， and has great potential to be used in natural protein extraction.

Keywords：other disciplines of bioengineering； binary aqueous two-phase system （BATPS）； extraction； globulin； albumin

清蛋白（又稱为白蛋白）与球蛋白是自然界中分布非常广泛的蛋白，几乎存在于所有动植物的体内[1-3]。球蛋白因具有免疫作用，所以也将之称为免疫球蛋白。清蛋白能溶于水、稀的酸溶液与碱溶液，同时可以沉淀于饱和硫酸铵溶液中；而球蛋白不溶于水，可溶于稀的盐溶液，能够被半饱和硫酸铵溶液沉淀[4-5]。由于清蛋白与球蛋白的功能存在差异，因此在实际生产中需要利用二者理化性质的不同将它们进行分离。球蛋白与清蛋白理化性质的不同导致在双水相体系中分配特性的不同，由此便可以改变二元双水相体系上下相的质量分数，对球蛋白和清蛋白进行分离，并且利于放大进行工业化生产。

近年来，在传统萃取技术基础上发展起来的高分子聚合物双水相萃取体系、表面活性剂双水相体系、小分子有机溶剂双水相萃取体系在分离/富集生物活性物质方面得到了广泛应用[6-9]。现有的双水相体系萃取技术大多采用的是一元双水相体系，中国对于二元双水相体系用于蛋白质的研究还比较少[10-11]。笔者在一元双水相体系的基础上，利用有机溶剂相似相溶的原理，根据不同种类有机物的特性和优点选取了乙醇和丙酮混合液作为新型二元双水相体系的有机相，构成新型体系对球蛋白和清蛋白进行萃取[12-14]。在（乙醇+丙酮） 体系中，通过加入硫酸铵形成二元双水相体系，考察了影响双水相形成的因素，重点考察了二元体系的组成对欧李种仁球蛋白和清蛋白分配行为的影响，为二元双水相体系萃取蛋白提供一定的理论基础。

1主要材料

成熟欧李种仁经初步分离得到的清蛋白和球蛋白粗制品。

牛血清蛋白、考马斯亮蓝、无水乙醇、丙酮、硫酸铵等，以上试剂均为分析纯。

紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司提供；电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司提供。

2实验方法

2.1欧李种仁球蛋白与清蛋白的制备

选取饱满均匀的成熟欧李种子，按照文献＼[15＼]的方法，采用碱提酸沉的方法获得总蛋白，之后经过系列操作分别得到欧李种仁的球蛋白和清蛋白粗制品，冷冻干燥后备用。将所得含清蛋白的上清液A与含球蛋白的上清液B冷藏备用。

2.2双水相萃取方法[16-19]

取5支刻度管编号。称取一定量乙醇和丙酮的混合液（二者体积比为1∶2）、硫酸铵固体、蛋白稀释液、蒸馏水于刻度管中，充分振荡使成相物质溶解。然后在每支刻度管内加入相应的蛋白稀释液，使双水相体系总质量为10.00 g，充分振荡后，静置10 min。两相分离，蛋白质富集于双水相系统的下相中，测定相比R（见式（1））和蛋白质的含量，并计算分配系数K（见式（2））及上下相的蛋白回收率Yt和Yb（见式（3）和式（4））。

式中：Yt和Yb分别代表上相和下相的蛋白回收率。

2.3球蛋白与清蛋白二元双水相体系的确定[12，18]

确定硫酸铵质量分数，改变有机相质量分数，分别计算出有机相质量分数不同的各个体系的分配系数，选取分配系数最小的体系中的有机相质量分数为最优体系的有机相。

选取分配系数最小的体系中的有机相质量分数且固定，改变硫酸铵质量分数，分别计算出硫酸铵质量分数不同的各个体系的分配系数，选取分配系数最小的体系中的硫酸铵质量分数为最优体系的盐相，由此可确定以上相应的有机相及硫酸铵即为萃取蛋白的最优体系。

3结果与分析

3.1（乙醇+丙酮）质量分数对欧李种仁球蛋白萃取的影响

在（乙醇+丙酮）/硫酸铵二元双水相体系中，固定硫酸铵质量分数为24%，与质量分数为15.0%，17.5%，20.0%，22.5%和25.0%的有机相及相应质量的蒸馏水组成二元双水相体系，使其为体系A。后于每支刻度管中加入1 mL球蛋白稀释液，充分振荡后静置10 min。待充分萃取后，分别读出上下相体积，且通过紫外分光光度计在595 nm处测得上下相溶液的吸光度值，如表1所示。

通过表1中溶液上下相的体积和吸光度計算出欧李种仁球蛋白在二元双水相体系1中的相比、分配系数和回收率，如表2所示。

对于实验所采用的二元双水相体系来说，希望蛋白质尽可能地分配在下相的硫酸铵溶液中，有机相质量分数对欧李种仁球蛋白分配系数和回收率的影响趋势如图1所示。

由图1可知，当有机相的质量分数为17.5%时，分配系数达到最小，且下相回收率达到最大。由此可确定萃取球蛋白的最佳体系中有机相的质量分数为17.5%。

3.2硫酸铵质量分数对欧李种仁球蛋白萃取的影响

在（乙醇+丙酮）/硫酸铵二元双水相体系中，固定有机相质量分数为17.5%，与质量分数为20%，22%，24%，26%和28%的硫酸铵及相应质量的蒸馏水组成二元双水相体系，使其为体系B。然后于每支刻度管中加入1 mL球蛋白稀释液，充分振荡后静置10 min。待充分萃取后，分别读出上下相体积，且通过紫外分光光度计在595 nm处测得上下相溶液的吸光度值，如表3所示（当有机相质量分数为17.5%、硫酸铵质量分数为20%时，加入球蛋白稀释液前双水相体系分层，加入蛋白后体系不再分层）。

通过表3中溶液上下相的体积和吸光度，计算出欧李种仁球蛋白在二元双水相体系B中的相比、分配系数和回收率，如表4所示。硫酸铵质量分数对球蛋白萃取的分配系数和回收率的影响趋势如图2所示。

由图2可知，当硫酸铵质量分数为24%时，分配系数达到最低且下相回收率达到最高。由此可确定该二元双水相体系萃取球蛋白最佳体系的硫酸铵质量分数为24%。

综上所述，当双水相中有机相质量分数为17.5%、硫酸铵质量分数为24%时，此体系为萃取欧李种仁球蛋白的最佳二元双水相体系。

3.3（乙醇+丙酮）质量分数对欧李种仁清蛋白萃取的影响

在（乙醇+丙酮）/硫酸铵二元双水相体系中，固定硫酸铵质量分数为24%，与质量分数为20.0%，22.5%，25.0%，27.5%和30.0%的有机相及相应质量的蒸馏水组成二元双水相体系，使其为体系C。然后于每支刻度管中加入1 mL清蛋白稀释液，充分振荡后静置10 min。待充分萃取后，分别读出上下相体积，且通过紫外分光光度计在595 nm处测得上下相溶液的吸光度值，如表5所示。

通过表5中溶液上下相的体积和吸光度计算出欧李种仁清蛋白在二元双水相体系C中的相比、分配系数和回收率，如表6所示。有机相质量分数对清蛋白萃取的分配系数及下相回收率的影响趋势如图3所示。

由图3可知，当有机相的质量分数为27.5%时，分配系数最小，且下相的回收率达到最高，所以萃取清蛋白最佳体系的有机相质量分数为27.5%。

3.4硫酸铵质量分数对欧李种仁清蛋白萃取的影响

在（乙醇+丙酮）/硫酸铵二元双水相体系中，固定有机相质量分数为27.5%，与质量分数为20%，22%，24%，26%和28%的硫酸铵及相应质量的蒸馏水组成二元双水相体系，使其为体系D。然后于每支刻度管中加入1 mL清蛋白稀释液，充分振荡后静置10 min。待充分萃取后，分别读出上下相体积，且通过紫外分光光度计在595 nm处测得上下相溶液的吸光度值，如表7所示。

通过表7中溶液上下相的体积和吸光度计算出欧李种仁清蛋白在二元双水相体系D中的相比、分配系数和回收率，如表8所示。硫酸铵质量分数对清蛋白萃取的分配系数和下相回收率的影响趋势如图4所示。

由图4可知，当硫酸铵质量分数为26%时，分配系数最小，且下相的回收率达到最高，所以萃取清蛋白最佳体系的硫酸铵质量分数为26%。

综上所述，当双水相中有机相质量分数为27.5%、硫酸铵质量分数为26%时，此体系即为萃取欧李种仁清蛋白的最佳二元双水相体系。

4结语

不同蛋白在相同溶剂中的溶解度会有所不同，这是由于理化性质不同造成的[20]。清蛋白与球蛋白的理化性质存在较大差异，清蛋白能溶于水，可以沉淀于饱和硫酸铵溶液中。球蛋白的亲水性不如清蛋白，不溶或微溶于水，能溶于稀盐溶液，在半饱和硫酸铵溶液中能够被沉淀，根据理化性质的不同就能对这2种蛋白进行分离。无机盐质量分数不同会导致蛋白质的溶解度有所不同[21]，因此相同蛋白质在二元双水相不同体系中的分配系数会有不同，固定其中一相的质量分数，改变另一相的质量分数，选择分配系数最小的相应质量分数作为萃取蛋白质的最优体系。

本实验采用二元双水相体系（乙醇+丙酮）（二者体积比为1∶2）/硫酸铵对欧李种仁的球蛋白和清蛋白进行萃取，确定了萃取球蛋白的最佳条件：有机相质量分数为17.5%，硫酸铵质量分数为24%。萃取清蛋白的最佳条件：有机相质量分数为27.5%，硫酸铵质量分数为26%。

本研究利用二元双水相系统对欧李种仁的清蛋白和球蛋白进行了萃取探索，初步获得了2种蛋白最优的萃取条件，为活性蛋白的分离纯化开辟了一条新的途径。本次实验并未对蛋白在此二元双水相系统中的分配行为进行深入探讨，今后应从萃取动力学方面入手进行深入研究，以期获得利用二元双水相萃取蛋白更多的数据，为活性蛋白的分离纯化提供重要的理论依据。

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