少突胶质细胞的分离培养方法

孟赞 唐栎

摘 要：改进少突胶质细胞体外培养方法。取新生24 h内SD大鼠大脑皮质组织，采用机械性吸管吹打的方法获取细胞悬液，进行种植培养，Galc免疫细胞化学法鉴定少突胶质细胞。经Galc免疫细胞化学染色，少突胶质细胞纯度达95%。采用此种方法培养出的少突胶质细胞纯化度高，且方便简易。

关键词：少突胶质细胞；分离培养

一、实验器械

钟表镊2把；眼科剪3把；小弯镊3把；大剪及大镊各1把；玻璃平皿3个；75cm2培养瓶；试管数只；试剂瓶数个弯；头吸管1个；计数板1个；冰板1个；白磁盘1个；饭盒盖1个；解剖镜一台。

二、实验试剂

DMEM/HIGHGLUCOSE；Nueroobasal；D-hanks液（无酚红）；0.25%胰蛋白酶；青霉素和链霉素双抗；多聚赖氨酸；胎牛血清；马血清；DNA酶；谷氨酰胺；bFGF；PDGF- AA；Galactocerebroside，GalC抗体；小鼠抗大鼠 A2B5 单克隆抗体 IgM。

三、实验准备

取材前一天，将所有金属器械置于同一个铝盒中高压消毒，玻璃器皿置于另外一个饭盒中高压消毒，2小时后取出放到烘干箱中烘干备用。包被：将0.1mg/ml多聚赖氨酸溶液吸到六孔板/皿中，平置30分鐘后，吸弃赖氨酸溶液，晾干。用前用高压过的去离子水洗三遍，再晾干备用。领取新生48h之内的SD大鼠。实验前一天将高糖DMEM在孵育箱中孵育过夜。

四、实验步骤

（1）取出高压灭毒物品，置于超净台中。

（2）在冰板上放置玻璃培养皿，皿中均加入适量解剖液，预留最后一套小培养皿不加。

（3）用75%酒精泡上钟表镊。

（4）配制3ml0.125%胰蛋白酶：1.5mL 0.25% 胰蛋白酶；300μL 0.1% DNA酶；解剖液稀释至3 mL。

（5）取新生24h内SD大鼠，75%的酒精消毒头部皮肤，用眼科剪依次切开皮肤颅骨及硬脑膜，然后取出脑组织放在PBS缓冲液中，将取出的脑组织放在解剖显微镜下，用小镊子剥除软脑膜、脑干、海马及血管组织。剩余的脑皮质切成1mm2的组织小块，放入盛有PBS的离心管中，然后用吸管轻轻反复的吹打。

（6）用 70μm 筛网过滤，剪碎后在 0.125%的胰蛋 白酶 中 37℃消化15min，用含有血清的DMEM培养基终止胰酶消化。轻轻吹打使细胞分散后，离心机l000 r/min离心lOmin，弃去上清液，加入10%FCS+DMEM/F12的培养液重悬离心后的细胞，细胞以约106/cm2浓度种植在75cm2的培养瓶内。

（7）细胞放入5%CO2 的培养箱中培养大约40min，翻转培养瓶几次后吸出细胞悬液，取出已经贴壁了的贴壁细胞，主要是成纤维细胞，把细胞的悬液种植在涂有多聚赖氨酸75cm2的培养瓶中，培养瓶内加入 8至10ml的10%FCS+DMEM/F12的培养液。

（8）有细胞种植的培养瓶静置3天，3天后隔天换液，培养至第9天。

（9）少突胶质细胞的分离与培养：在接种9天，细胞达到融合后，根据少突胶质细胞和星形胶质细胞系黏附特性的差异和生长时间的不同，本实验采取差速震荡法对少突胶质细胞进行分离和纯化。首先在37℃恒温摇床上低速震荡来去除小胶质细胞（200rpm，1h—2h），此处收集小胶质细胞（收集振摇下来的细胞悬液，1000xg在4℃离心10 min，弃上清，细胞用适量完全培养液重悬，调整细胞密度，接种于培养皿中，4 h后收集未贴壁细胞。换新鲜培养液继续培养。原混合胶质细胞培养瓶，PBS洗涤2次，加入新鲜培养液，不换液培养7 d，按上述方法再次获得MG）更换（10%FCS+DMEM/F12）培养基，培养2～4h 后再放入37℃培养箱。在恒温摇床上用高速震荡法过夜（200rpm.，18～20h），此时收集的摇下来的细胞用吸管收集种植在未处理过的培养瓶上，把培养瓶放在37℃的细胞培养箱内30至60min，目的是使混杂在细胞悬液中的星形胶质细胞及小胶质细胞贴壁，然后把细胞悬液种植在涂有多聚赖氨酸75cm2的培养瓶内，培养液为含含有细胞因子的少突胶质细胞的培养液，采取半量换液法隔天换液，培养 4-5 天，促进 OPCs 分裂增殖，再次在恒温摇床上用高速震荡法 （180rpm，1h）分离传代，进一步使少突胶质细胞纯化。

（10）用细胞免疫荧光法鉴定少突胶质细胞并测算少突胶质细胞纯度。24孔板每孔底部放置孔径相同的的载玻片，少突胶质细胞以3×104/L的密度种植在24孔板上培养1天。1天后吸弃24孔板上的培养液，用PBS缓冲液洗涤少突胶质细胞3次，每次10min。用4%的多聚甲醛固定玻片约20min，PBS缓冲液浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS。在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min。吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释小鼠抗大鼠 A2B5 单克隆抗体，稀释度为1：500，放入湿盒，4℃孵育过夜。第二天，PBS缓冲液浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的山羊抗小鼠 IgM 抗体，湿盒中37℃孵育1h，PBS缓冲液浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBS缓冲液5min×4次洗去多余的DAPI。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。随机选取20个视野在荧光显微镜下观察，免疫荧光染色阳性细胞为少突胶质细胞体细胞，计数摄影；同一视野于普通光条件下计数细胞总数，计算少突胶质细胞前体细胞细胞纯度。