浅析红细胞凝集抑制试验的影响因素

胡燕玲 高习文

摘要：在兽用生物制品特别是兽用疫苗产品检验过程中，红细胞凝集抑制试验在禽灭活疫苗效力检验和禽抗体效价测定中应用广泛，是一个非常基础的常规的试验。但是在试验操作中由于其影响因素较多，很容易造成试验结果的偏差，对检验结果造成影响，因此就红细胞凝集抑制试验的影响因素进行分析，给疫苗检验操作人员提供参考，以减少弯路。

关键词：红细胞凝集抑制试验；影响因素；兽用生物制品

中图分类号：S852.5

文献标识码：B

文章编号：2095-9737（2018）08-0014-01

红细胞凝集抑制试验（HI）的原理为鸡红细胞表面存在受体，而某些病毒如鸡新城疫病毒等能与鸡红细胞表面受体结合而产生凝集现象，称为红细胞凝集（HA），而当这种病毒与相应的特异性抗体相结合后，这种凝集现象则被抑制，称为红细胞凝集抑制试验。试验依据：中国兽药典（2015年版）三部附录3404。根据经验，有以下几个主要影响因素需要检验人员在试验中注意。

1 试剂及器材

整个实验过程中均应按照兽药典要求使用PBS（O.l mol/L，pH 7.0—7.2，下同），而不是生理盐水，因PBS缓冲能力较好，实验结果较为稳定。

操作过程中使用的器材有：50孔反应板、96孔反应板、移液器、枪头、平皿或移液槽等。

移液器应选用品牌的单道或多道移液器，配套使用品牌移液器枪头，若枪头不配套则加液量可能不准，影响实验结果。使用过程中应严格按照移液器说明书要求使用，使用后应旋至最大刻度处保存，并定期校验，合格方可使用。枪头应一次性使用，不能清洗后再重复使用。反应板、平皿或移液槽等均应清洁，使用后应立即清洗干净。若条件允许可选用一次性使用反应板或器皿，一次性使用。对于重复使用的50孔或96孔反应板，应在试验操作结束后立即清洗。清洗方法为：弃去液体（弃人含有消毒液的盆或桶中），用纯化水冲洗各孔，用75%酒精棉球擦拭各孔，然后用纯化水冲洗干净，烘干或自然晾干后备用。注意用棉球擦拭反应板时，应避免刮伤反应孔。对于初学者建议使用50孔板进行试验，反应结果观察更为清晰准确，易判定。

2 1%鸡红细胞悬液

若配制的1%红细胞浓度偏高，则红细胞凝集试验（HA）反应结果血凝价会偏低，红细胞凝集抑制试验（HI）反应结果抗体效价偏高；若配制的1%红细胞浓度偏低，则红细胞凝集试验（HA）反应结果血凝价会偏高，红细胞凝集抑制试验（HI）反应结果抗体效价偏低。因此红细胞配制浓度对反应结果的影响至关重要。而影响红细胞悬液浓度的因素分别有红细胞保护液（阿氏液）、采血过程，红细胞离心配制过程等。

2.1 阿氏液

阿氏液成分为柠檬酸钠8g，柠檬酸0.325 g葡萄糖20.5g，氯化钠4.2 g加纯化水至1000 mL。

因柠檬酸的用量较少，称量要求较为精确，因此应选择至少精确至0.001 g的电子天平进行称量；因其中含有较多的葡萄糖，因此不宜采用较高的温度和压力进行灭菌，适宜的方法为流通蒸气灭菌3次，每次30 min，可室温保存使用。

2.2 采血过程

最好选用2～4只2～6月龄的SPF鸡，用一次性或灭菌的5 mL注射器，翅下静脉采血，抽取血液时速度不能太快也不能太慢，避免溶血及凝血，采血后应立即取下针头将血液缓缓推入等量的阿氏液或略多于血液量的阿氏液中，轻轻摇匀备用。应避免用针头直接将血液推入阿氏液中，防止造成溶血。采血后应用干棉球按压采血部位进行止血。

2.3 1%红细胞配制

采血后血液置阿氏液中4℃保存或直接离心。离心时应采用1500 r/min离心5—10 min，然后用PBS洗涤3～4次。尽量不使用生理盐水洗涤，因PBS有缓冲作用，能避免在离心过程中造成溶血。每次洗涤时应尽可能的弃净上清，在最后一次离心过程中时间一定要达到10 min以上，使红细胞沉积较为坚实。因无法完全弃净红细胞泥上层的白细胞层及上清，因此在最后吸取红细胞泥时，应将吸管或吸头插入离心管底部吸取，确保抽取的全部为红细胞，加入红细胞后应在瓶中无红细胞泥处反复轻轻吹吸洗净吸管或吸头中黏附的红细胞。配制好的红细胞放置2～8℃保存，3～5日内使用，若有条件红细胞尽可能现用现配。对1%红细胞悬液可按中国兽药典（2015年版）三部附录3404附注要求进行标定，确保配制浓度准确。

3 4倍血凝素对试验结果的影響

在红细胞凝集抑制试验中的关键为4倍血凝素的配制，需要准确测定血凝素的凝集价并对配制的4倍血凝素进行检验。4倍血凝素配制浓度如果不准确则红细胞凝集抑制试验结果会有很大的影响。配制浓度偏高，则红细胞凝集抑制试验结果偏低；配制浓度偏低，则红细胞凝集抑制试验结果偏高。 在操作过程中需要注意是为了和后续抑制试验反应体系液体量保持一致，在血凝素凝集价测定和4倍血凝素检验过程中需要补加的PBS（具体请参照中国兽药典2015年版三部附录）。此外配制好的血凝素可在2～8℃条件下储存，应现用现配；原液应避免反复冻融，可先分装成小包装进行冻存。每次试验均应先测定血凝素凝集价，避免因使用不同的红细胞或其他实验因素变动造成结果的不准确。

4 操作过程

加液时严格按照移液器的使用方法，采用多吸少打或全排的加液方式均可，确保加液量准确。

加液过程应避免将液体加到孔外或溅出孔外，造成反应体系量不准确，每次加液时，应避免枪头接触反应板孔内液面。

在稀释过程中，吹吸混匀次数应至少6次，枪头深入液面深度应适中，避免吸空和溅出。在吹吸混匀后移液时，应排净吸头内液体，重新吸取准确量加入下一孔继续混匀稀释。红细胞在使用前应摇匀，加样孔较多时，应注意经常摇匀。在整个操作过程中应随时注意移液器液面位置，确保加液量准确。

5 反应环境温度及判定方法

红细胞凝集和红细胞凝集抑制试验要求实验反应温度为室温（15～25℃）或2～8℃。室温条件下，20—40 min即可判定，2～8℃条件下需要40～60 min可判定结果。环境温度较高，则红细胞凝集试验及红细胞凝集抑制试验反应的时间较短；环境温度较低，则红细胞凝集试验及红细胞凝集抑制试验反应的时间较长。判定方法为：在特定温度及规定的时间内，以红细胞对照在反应板底部形成边缘光滑的圆点（即呈显著纽扣状）时开始判定.以完全凝集（100%凝集）或完全抑制（lOO%）的最高稀释倍数作为反应终点。