设施甜瓜种植年限对土壤生物学特性和细菌多样性的影响

唐小付　刘岳飞　张传进　姚华开　杨尚东

摘 要 以广西北海市种植不同年限的设施甜瓜土壤为研究对象，研究甜瓜不同种植年限对其设施土壤的理化、生物学性状的影响和细菌多样性的演变规律。结果表明：随着种植年限的增加，设施土壤EC值随着设施种植年限的增加逐年增大，而pH值却随着设施种植年限的增加而下降，两者均以种植3 a后变化幅度增大；另一方面，设施土壤中可培养微生物的数量，以及涉及碳、氮、磷循环相关酶活性和微生物生物量（C、N、P）亦随着种植年限的增加而逐年下降，特别是种植3 a后的下降幅度表现出甚为剧烈的趋势；同时，设施土壤细菌多样性指数（H）、丰富度（S）和均匀度（Eh）指数亦随着设施栽培年限的增加而降低，同样表现出种植3 a后下降幅度加剧的趋势。此外，测序结果显示种植3 a后，设施土壤优势细菌种属主要以不可培养细菌为主；而且导致了诸如芽孢杆菌属、根瘤菌属等部分有益细菌种属的缺失。基于上述结果可知：施用化肥为主的甜瓜设施栽培连续3 a后易出现土壤肥力下降、质量劣化、发生盐渍化等危害。

关键词 甜瓜；设施栽培；盐渍化；细菌多样性；PCR-DGGE

中图分类号 S154.36 文献标识码 A

Abstract Soil physiochemical and biological properties， bacterial diversity under different growing years in protected cultivation of melon were systematically investigated in Beihai， Guangxi in south China. The results showed that soil electrical conductivity （EC） increased and soil pH decreased with more protected cultivation years. In particularly， soil EC and pH were significantly changed three years later under protected cultivation. In addition， the number of soil cultivable microbes， enzyme activities which related to the carbon， nitrogen and phosphorus cycles in soil and microbial biomass carbon， nitrogen and phosphorus were all decreased with more protected cultivation years， particularly three years later under protected cultivation condition. Meanwhile， soil bacterial diversity index （H）， richness （S） and evenness index （Eh） in protected cultivation also showed the same trend. Moreover， some bacteria groups， such as Bacillus （sp.） and rhizobia， which belonged to the beneficial microorganism， disappeared in soil after three years protected cultivation. Based on the above results， it indicated that the degradation of soil， such as soil fertility decline and salinization in southern China would easily happen with the application of chemical fertilizers only after three years under continuously protected cultivation.

Keywords melon （Cucumis melo L.）； protected cultivation； salinization； bacterial diversity； PCR-DGGE

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.004

甜瓜（Cucumis melo L.）屬葫芦科（Cucur?bitaceae）甜瓜属一年生蔓性草本植物。广西厚皮甜瓜的种植始于20世纪90年代中期，主要产区分布在南宁、北海、百色、崇左等市县。广西地区采用设施避雨栽培方式种植，与北方厚皮甜瓜上市的高峰期错开种植，效益显著及市场种植模式迅猛发展。截至2016年，广西厚皮甜瓜的栽培面积已发展至2 000 hm2；然而，广西甜瓜产区的甜瓜生产中，至今仍采用水分与肥料分开管理的传统生产模式。存在着盲目施肥、劳动强度高、占用劳力多、肥料利用率低、浪费严重的弊端[1]，严重阻碍了广西甜瓜产业的健康发展。南方厚皮甜瓜的栽培多采用设施栽培方式，导致长期覆盖栽培、高度集约经营、设施环境内水、热失衡以及南方高温、多湿等原因。以北方的设施种植相比，会更早地出现土壤盐渍化、酸化、养分失调、微生物区系破坏、土传病害加重等一系列土壤质量退化及连作障碍问题[2]。如今，已成为制约广西设施蔬菜生产可持续发展的瓶颈。虽然土壤理化性状能一定程度地量化土壤肥力状况，但不能直接反映土壤中生命体的活动以及评价土壤的健康状况。土壤生物学特性则可以弥补这一缺陷，是土壤质量评价不可缺少的指标[3]。此外，土壤微生物指标目前已被公认为土壤生态系统变化的预警及敏感指标[4]。在土壤微生物中数量最多、分布最广是细菌，参与土壤有机质分解和矿化过程的主要门类，在化学物质循环、降解污染和修复生态环境方面起着重要作用[5]。其群落结构与组成能够反映出土壤养分变化乃至环境变化带来的影响，并能直接影响土壤功能的发挥[6]。

因此，本研究通过种植年限对南方厚皮甜瓜设施土壤理化、生物学性状及细菌多样性的影响。利用指示土壤肥力与健康状况的理化和生物学指标，综合评价南方设施土壤盐渍化及质量劣化的种植年限，弄清设施土壤劣化的确切原因，旨在针对性地提出南方厚皮甜瓜设施栽培中进行土壤改良的方法与确切时间，为构建节本、高效的南方厚皮甜瓜设施种植模式提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况与背景

本试验土壤采于广西北海市厚皮甜瓜主产区，该产区位于东经1084519，北纬215150，属亚热带海洋性季风气候。全年平均日照时数2 009 h，平均降雨量1 670 mm，年平均气温 22.8 ℃左右。本文调查的甜瓜设施均为钢架结构的塑料大棚，大棚长度30 m左右，宽6 m，棚高3.0 m。室内种植的厚皮甜瓜品种均为“南蜜10号”，其生产茬口分别为春茬1—2月播种，秋茬8—10月播种。种植前按667 m2施用沤熟的农家肥2 000 kg，钙镁磷肥30～35 kg，硫酸钾20～25 kg，三元复合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）30～ 40 kg作为基肥一次性施入，追肥方法如下：当瓜藤长至15～25 cm时进行第一次追肥，用量占总用量的20%；当第一个瓜长到鸡蛋大小时进行第二次追肥，用量占总用量的30%；第三次追肥在第一个瓜直径达20 cm左右时进行，用量占总用量的20%，追肥次数依土壤肥沃程度和长势而异。

1.2 样品采集及处理

土壤样品于2016年5月在北海市设施厚皮甜瓜产区相同农户15个相邻、且种植年限依次为1、2、3、4、5 a（每年3个重复）的设施中分别采集，并以棚外相邻的露地栽培甜瓜作为对照（CK），按“S”字形采样法采集耕作层（0～30 cm）土壤。采集5～8个点组成一个混合样品，去除残根等杂物后，充分混匀并用无菌塑料袋装好，带回实验室。将每份土壤样品分为2部分：一部分室内自然风干后过40目筛，用于土壤理化性状测定；另一部分过10目筛后，置于4 ℃冰箱保存，用于土壤生物学性状及细菌群落结构分析。

1.2.1 土壤理化性状分析 土壤EC值采用FE30电导率仪，土壤pH值采用PHS-3C型精密酸度计，有机质采用重铬酸钾滴定法，全氮采用半微量凯氏法，全磷采用氢氧化钠碱熔融——钼锑抗比色法，全钾采用氢氧化钠熔融——火焰光度法，碱解性氮采用碱解扩散法，速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提——钼蓝钼锑抗比色法，速效钾采用1 mol/L NH4OAc浸提——火焰光度法[7]测定。

1.2.2 土壤生物学性状分析 土壤可培养微生物数量测定采用稀释平板法[8]，土壤中C、N、P循环相关酶β–葡糖苷酶（β-glucosidase）活性测定采用Hayano[9]的方法，氨肽酶（aminopeptidases）活性测定采用Ladd[10]的方法，磷酸酶（phosph?atase）活性测定采用Tabatabai等[11]的方法。微生物生物量碳测定采用氯仿熏蒸提取——滴定分析法[12]；微生物生物量氮：测定采用氯仿熏蒸提取——茚三酮比色法[13]；微生物生物量磷测定采用氯仿熏蒸提取——磷钼蓝比色法[14]。

1.2.3 土壤细菌群落结构分析 土壤微生物基因组总DNA提取参照Krsek和Welington[15]的方法。土壤细菌16S rDNA V3可变区的PCR扩增采用降落PCR（Touchdown PCR）的方法。上游引物序列为GC-338F：5-CGCCCGCCGCGCGCGG?CG-GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3；下游引物为R518：5-AT-TACCGCGGCTGCTGG-3[16]。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用Bio-Rad公司DCodeTM基因突变检测系统（DCode Universal Mutation Detection System，Bio-Rad）对PCR反应产物进行分离。变性剂浓度30%～60%（100%变性胶为7 mol/L尿素和40%去离子甲酰胺的混合物）；PCR产物加样量40 μL；60 ℃、120 V的恒定电压条件下，电泳6 h。电泳完毕后银染20～30 min，再用Bio-Rad公司GS-800TM Calibrated Densitometer观察并扫描成图像。细菌16S rDNA片段的克隆和测序：切下目的条带，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒进行胶回收，以不含GC片段的引物对F338和R518再次进行PCR扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶检测，将含有目的片段的PCR产物纯化后，与PMD18-T载体（TaKaRa，产品号：K6701AA）连接进行克隆，将含有目的条带的菌液送上海生工測序。测序结果于NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列同源性比对与分析。

1.3 数据处理

实验数据采用Excel 2010和SPSS 19.0统计软件对试验数据进行统计分析，平均数据以“平均数±标准差（SD）”表示，多重比较采用邓肯

氏新复极差检验法（Duncans multiple ranger test，DMRT）。使用Quantity one（V4.6.9）分析软件对DGGE图谱进行分析，多样性指数（H）、丰富度（S）和均匀度（Eh）的计算参照马宁宁等[17]的方法。

2 结果与分析

2.1 设施甜瓜种植年限对设施土壤理化性状的影响

由表1可知，与露地栽培土壤相比，设施甜瓜土壤全氮、全磷与全钾含量并没有呈现出随着种植年限的增加而出现有规律的变化趋势；同样的碱解氮、速效磷和速效钾含量，也没有呈现出随着设施种植年限的增加呈现逐渐增加或减少的规律性变化。但是，设施土壤EC值随着设施种植年限的增加而逐渐增大，呈现出：5 a>4 a>3 a>2 a>1 a>露地的变化趋势。尤其以第3年的变化最为显著，增幅为种植第2年数值的2倍以上；pH值则表现出随着设施种植年限的增加而逐渐减小的趋势，而且也是设施种植第3年时降幅最大。结果表明随着设施种植年限的增加，设施土壤呈现土壤酸化的趋势；设施土壤中的有机质含量随着设施种植年限的增加逐年减少，尤其是设施种植第3年起则显著低于露地栽培土壤。因此，甜瓜设施种植3 a后设施土壤呈现出有机质含量显著降低、土壤酸化和盐渍化加剧的趋势。

2.2 设施甜瓜种植年限对设施土壤生物学性状的影响

2.2.1 设施甜瓜种植年限对设施土壤可培养微生物的影响 由表2可知，设施甜瓜土壤中可培养细菌、真菌和放线菌数量在设施种植的前3

年变化幅度较小，除设施种植第1年土壤的可培养真菌显著小于第2年、第3年外，设施种植前3 a的设施土壤中可培养细菌、放线菌数量均无显著差异；但随着种植年限的增加，从第4年开始，无论是可培养细菌、真菌或放线菌数量均显著低于第2年、第3年设施土壤中的微生物数量。与对照甜瓜露地栽培相比，设施土壤中可培养细菌数量前3 a均显著高于对照，但从第4年开始显著减少，设施种植第5年则显著低于露地栽培；同样地设施土壤中可培养真菌、放线菌数量均表现出与可培养细菌类似的变化趋势。结果表明：南方设施甜瓜土壤中可培养微生物（细菌、真菌和放线菌）数量在设施种植的前3 a显著高于露地或与露地之间并无显著差异；但随着种植年限的增加，尤其从第4年开始设施土壤中可培养微生物数量呈现显著下降的趋势。

2.2.2 设施甜瓜种植年限对设施土壤酶活性的影响 由表3可知，涉及土壤碳、氮、磷循环相关酶（β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶）活性随着设施种植年限的增加呈现复杂的变化趋势。其中，β-葡糖苷酶活性呈现降低、升高后降低的变化趋势，尤其是设施种植年限达3 a后显著低于相应露地土壤的β-葡糖苷酶活性；磷酸酶活性表现出与β-葡糖苷酶活性相一致的变化趋势，先降低后升高、再降低的变化趋势，但各个设施年限之间并不存在显著差异，而且与露地土壤之间并不存在显著差异；氨肽酶活性则直接表现出先升高后降低的变化趋势。总之，可作为指示土壤肥力生物学指标之一的3种土壤酶活性并没有随着设施种植年限的增加表现出规律性的变化。

2.2.3 设施甜瓜种植年限对设施土壤微生物生物量的影响 设施种植甜瓜土壤中微生物生物量碳、磷均是设施种植的第1年达到最高值，其后逐年下降；而微生物生物量氮则表现出更为复杂的变化趋势，其在设施种植第2年达到最高值，并在设施种植第5年显著下降，与设施种植第2年相比呈显著下降趋势。此外，除第1年设施土壤微生物生物量磷之外，设施土壤中的微生物生物量碳、氮、磷在设施栽培的前3 a间与露地土壤之间均无显著差异，但种植第3年以后均出现逐渐递减的趋势（表4）。

2.3 设施甜瓜种植年限对设施土壤细菌群落结构的影响

2.3.1 土壤细菌16S rDNA基因V3区扩增 以提取的土壤微生物总DNA为模板，GC-F338和R518为扩增引物，对16S rDNA V3可变区进行PCR扩增。如图1所示，16S rDNA片段长度为250 bp左右，特异性好，无杂带，与理论值相符，PCR扩增效果良好，扩增产物可以进行DGGE实验。

2.3.2 土壤细菌群落DGGE图谱分析 应用DGGE技术分离16S rDNA V3区片段PCR产物，可分离到数目不等、位置各异的电泳条带（图2）。

根据DGGE能分离长度相同而序列不同DNA的原理，每一个条带大致与群落中的一个优势菌群或操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）相对应，条带数越多，说明微生物多样性越丰富；条带染色后的荧光强度越亮，表示该种属的数量越多，并由此反映土壤中的微生物种类与数量[15]。比较设施不同种植年限条件下土壤细菌16S rDNA V3区片段PCR产物的DGGE图谱发现，甜瓜种植不同年限设施土壤细菌DGGE图谱的条带数为22～28条不等，均小于露地的33条。

此外，基于细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱中各泳道中条带的数目和灰度值计算了细菌的均匀度（evenness，E）和多样性指数（Shannon- Wiener，H）。结果如表5所示，设施不同种植年限土壤细菌多样性指数的大小顺序为：露地（CK，3.46）>第3年（3.31）>第1年（3.30）>第2年（3.20）>第4年（3.19）>第5年（3.09）。这一结果表明，与露地栽培相比，南方甜瓜的设施栽培一定程度地引起了土壤细菌多样性的降低，而且随着设施种植年限的增加，呈现细菌多样性指数递减的趋势。

均匀度表示物种在环境中的分布状况，各个物种数目越接近，数值越高[18]。由表5可知，与露地栽培相比，设施种植第1年至第4年间土壤细菌均匀度指数均维持在高于或等同于露地土壤相应的数值水平。但是第5年则表现出较为显著的下降趋势。因此，土壤细菌丰富度和多样性指数亦表现出类似的变化趋势。

2.3.3 細菌16S rDNA片段的序列分析 从DGGE分离后的条带中选取灰度值较高，且比较清晰的条带进行切胶回收、重新PCR扩增和测序，获得14条测序结果（图2）。将14个序列于NCBI GenBank数据库中进行检索和同源性比对，选择与测序序列相似性最高的一条序列作为参考对象，结果如表6所示。切胶回收条带测序序列与已发表序列的相似度达到98%～100%。有9个条带测序序列为不可培养细菌，占总序列数的64.29%，条带8测序序列与已发表的序列比对，最相似序列属于芽孢杆菌属的细菌。条带9和12的测序序列比对结果均属于鞘氨醇单胞菌属，条带10、11、14的测序序列比对结果分别与黄单胞菌属、根瘤菌属和鞘氨醇单胞菌属的相似度最高。

3 讨论

土壤次生盐渍化和酸化是作物设施种植中普遍存在的障碍因子。土壤EC和pH是评价土壤盐渍化和酸化的重要指标。本研究中，设施甜瓜土壤EC均显著高于相应的露地土壤，但与设施种植第1年、第2年土壤的EC与露地相比，增幅不明显，变化幅度仅介于5～28 μS/cm之间；从设施种植3 a开始土壤EC却从原来220～ 250 μS/cm剧增至515 μS/cm左右，是露地土壤EC的2.34倍，随着设施种植年限的增加而逐年递增；与露地土壤pH相比，设施土壤pH均显著低于露地土壤，虽然pH在各个设施年限土壤之间无显著差异，但亦呈现逐年递减的趋势。上述结果表明：该产区厚皮甜瓜设施种植3 a后，设施土壤EC值剧增，pH持续下降，后续的厚皮甜瓜设施种植出现土壤酸化和盐渍化危害的可能性剧增。

土壤微生物是土壤生态系统变化的敏感生物学指标，其活性和多样性的变化能敏感地反映出土壤生态系统的质量和健康状况[19]。土壤微生物数量受土壤养分含量、作物类型以及作物感病与否等理化及生态因素的影响[20]。本研究的结果说明厚皮甜瓜设施土壤中可培养细菌、真菌和放线菌数量在设施种植的前3 a变化幅度小，基本上设施种植前3 a土壤中可培养细菌、放线菌数量均无显著差异；从第4年开始，随着种植年限的增加，无论是可培养细菌、真菌或放线菌数量均显著减少，与对照相比，设施种植前3 a土壤中可培养细菌数量顯著高于对照。但从第4年开始显著减少，设施种植第5年则显著低于露地栽培。这一结果与周德平等[21]研究种植年限对设施芦笋土壤微生物的影响相类似。

土壤酶参与土壤中几乎所有的有机物质和营养元素的循环，是土壤生物学特征的重要指标[22]。土壤酶对环境变化十分敏感，与土壤pH、有机质、含盐量等密切相关[22-23]，其活性大小能够预示土壤生态系统功能变化的多样性和稳定性[24]。前人的研究认为土壤酶活性是评价土壤健康和肥力水平的重要指标[25]。本研究发现无论是涉及土壤碳循环的β-葡糖苷酶，抑或涉及土壤氮循环的氨肽酶以及涉及磷循环的磷酸酶，并没有随着设施年限种植年限的增加呈现出规律性的显著变化。杨琴等[26]研究种植年限对蔬菜日光温室土壤微生物区系和酶活性的影响亦发现，土壤中磷酸酶、蛋白酶等土壤酶活性亦随着设施种植年限的增加呈现先增强后减弱的趋势。这一现象说明单一的土壤酶活性指标难以指示南方厚皮甜瓜设施土壤肥力变化的状况，需结合土壤微生物数量以及微生物生物量等生物学指标进行综合评价。

土壤微生物生物量亦是衡量土壤质量、维持土壤肥力和作物生产力的一个重要指标[27]。厚皮甜瓜设施土壤中微生物生物量碳、氮、磷在设施栽培的前3 a间变幅较小，除微生物生物量磷之外，前3 a设施土壤的微生物生物量碳、氮均与露地土壤之间无显著差异，但设施种植第3年以后逐渐呈现递减趋势。宋蒙亚等[28]曾报道设施菜地土壤微生物量碳在设施种植前期（3 a）达最高，其后显著降低。与本研究发现南方厚皮甜瓜的设施栽培同样存在设施土壤质量随着种植年限的增加退化的现象相一致。

土壤微生物种群的组成和数量变化可以反映土壤质量优劣和肥力水平[29]。自从Muyzer等[30]首次将PCR-DGGE技术应用于微生物生态学研究以来，已越来越多地将其作为主要的分子工具之一，用于研究微生物群落结构、多样性以及种群的动态变化。根据DGGE的分析原理，每一个条带大致与群落中的一个菌群相对应，DGGE条带数量基本体现了微生物种群数量，而条带亮度则反映了该菌类数量的多少[31]。本研究针对南方设施甜瓜不同种植年限对设施土壤细菌多样性的分析结果显示，切胶回收条带测序序列与已发表序列的相似度达到98%～100%。有9个条带测序序列为不可培养细菌，占总序列数的64.29%，随着设施种植年限的增加，微生物多样性指数（H）、丰富度（S）和均匀度（Eh）指数均呈现下降的趋势，尤其是设施种植第4年以后，降低的幅度更为明显。测序结果还显示设施种植3 a以后，设施土壤中优势细菌种属主要以不可培养细菌为主。因此，设施种植第3年后，设施土壤中诸如芽孢杆菌属（条带8）、鞘氨醇单胞菌属（条带9）、根瘤菌属（条带11）等部分有益细菌种属数量减少或缺失，呈现出随着设施种植年限的增加出现土壤质量劣化的趋势。

参考文献

[1] 覃 武， 覃斯华， 洪日新， 等. 广西大棚厚皮甜瓜水肥一体化栽培关键技术[J]. 中国瓜菜， 2016， 29（4）： 38-40.

[2] 李文信， 黄金艳， 覃斯华， 等. 桂粤地区西甜瓜生产现状、存在的问题及其对策[J]. 中国瓜菜， 2009（2）： 50-51.

[3] 黎 宁， 李华兴， 朱凤娇， 等. 菜园土壤微生物生态特征与土壤理化性质的关系[J]. 应用生态学报， 2006， 17（2）： 285-290.

[4] 任天志. 持续农业中的土壤生物指标研究[J]. 中国农业科学， 2000， 33（1）： 68-75

[5] Sura S， Waiser M J， Tumber V， et al. Effects of a herbicide mixture on primary and bacterial productivity in four prairiewetlands with varying salinities： an enclosure approach[J]. Science of the Total Environment， 2015， 512-513： 526-539.

[6] Arroyo P， de Miera L E S， Ansola G. Influence of environmental variables on the structure and composition of soil bacterial communities in naturaland constructed wetlands[J]. Science of the Total Environment， 2015， 506-507： 380–390.

[7] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 北京： 中国农业出版社， 2011.

[8] 林先贵. 土壤微生物研究原则与方法[M]. 北京： 中国农业出版社， 2010.

[9] Hayano K A method for the determination of β-glucosidase activity in soil[J]. Soil Science & Plant Nutrition， 1973， 19（2）： 103-108.

[10] Ladd J N. Properties of proteolytic enzymes extracted from soil[J]. Soil Biology & Biochemistry， 1972， 4（2）： 227-237.

[11] Tabatabai M A， Bremner J M. Use of P-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity[J]. Soil Biology & Biochemistry， 1969， 1（4）： 301-307.

[12] Vance E D， Brookes P C， Jenkinson D S. An extraction method for measuring soil microbial biomass C[J]. Soil Biology & Biochemistry， 1987， 19（6）： 703-707.

[13] Joergensen R G， Brookes P C. Ninhydrin-reactive nitrogen measurements of microbial biomass in 0.5m K2SO4 soil extracts[J]. Soil Biology & Biochemistry， 1990， 22（8）： 1 023- 1 027.

[14] 吳金水， 肖和艾， 陈桂秋， 等. 旱地土壤微生物磷测定方法研究[J]. 土壤学报， 2003， 40（1）： 70-78.

[15] Kresk M， Wellington E M H. Comparison of different methods for the isolation and purification of total community DNA from soil[J]. Journal of Microbiological Methods， 1999， 39（1）： 1-16.

[16] Lambais M R， Otero X L， Cury J C. Bacterial communities and biogeochemical transformations of iron and sulfur in a high saltmarsh soil profile[J]. Soil Biology & Biochemistry， 2008， 40（11）： 2 854-2 864.

[17] 马宁宁， 李天来. 设施番茄长期连作土壤微生物群落结构及多样性分析[J]. 园艺学报， 2013， 40（2）： 255-264.

[18] 陈法霖， 张 凯， 郑 华， 等. PCR-DGGE技术解析针叶和阔叶凋落物混合分解对土壤微生物群落结构的影响[J]. 应用与环境生物学报， 2011， 17（2）： 145-151.

[19] 钟文辉， 蔡祖聪. 土壤管理措施及环境因素对土壤微生物多样性影响研究进展[J]. 生物多样性， 2004， 12（4）： 456-465

[20] 杨尚东， 吴 俊， 赵久成， 等. 番茄青枯病罹病植株和健康植株根际土壤理化性状及生物学特性的比较[J]. 中国蔬菜， 2013（22）： 64-69.

[21] 周德平， 禇长彬， 刘芳芳， 等. 种植年限对设施芦笋土壤理化性状、微生物及酶活性的影响[J]. 植物营养与肥料学报， 2012， 18（2）： 459-466.

[22] 杨 宁， 杨满元， 雷玉兰， 等. 衡阳紫色土丘陵坡地土壤酶活性对植被恢复的响[J]. 生态环境学报， 2014， 23（4）： 575-580.

[23] Capriel P， Beck T， Borehert H， et al. Relationship between soil aliphatic fraction extracted with supercritical hexane， soil microbial biomass， and soil aggregate stability[J]. Soil Science Society of America Journal， 1990， 54（2）： 415.

[24] Sowerb Y A， Emmet T B， BeieR C， et al. Microbial community changes in health and soil communities along a geographical gradient： Interaction with climate change manipulations[J]. Soil Biology & Biochemistry， 2005， 37（10）： 1 805-1 813.

[25] Ahamadou B， Huang Q， Chen W， et al. Micro calorimetric assessment of microbial activity in long-term fertilization experimental soils of Southern China[J]. FEMS Microbiology Ecology， 2009， 70（2）： 186-195.

[26] 杨 琴， 李 良. 种植年限对蔬菜日光温室土壤微生物区系和酶活性的影响[J]. 应用生态学报， 2013， 24（9）： 2 539- 2 544.

[27] Powlson D S， Brookes P C， Christensen B T. Measurement of soil microbial biomass provides an early indication of changes in total soil organic matter due to straw incur?pora-tion[J]. Soil Biology & Biochemistry， 1987， 19（2）： 159-164.

[28] 宋蒙亚， 李忠佩， 吴 萌， 等. 不同种植年限设施蔬菜土壤微生物量和群落结构的差异[J]. 中国农业科学， 2015， 48（18）： 3 635-3 644.

[29] 李秀英， 赵秉强， 李絮花， 等. 不同施肥制度对土壤微生物的影响及其与土壤肥力的关系[J]. 中国农业科学， 2005， 38（8）： 1 591-1 599.

[30] Muyzer G， Smalla K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE） and temperature gradient gel electrophoresis （TGGE） in microbial ecology[J]. Antonie Van Leeuwenhoek， 1998， 73（1）： 127-141.

[31] 杨尚东， 吴 俊， 谭宏伟， 等. 南方红壤区西南桦和马尾松人工林土壤微生物活性及细菌多样性比较[J]. 生态环境学报， 2014（3）： 415-422.