垂叶榕瘿花发育特性的初步研究

贾效成　陈良秋

摘 要 研究榕属植物瘿花发育特性是理解榕树/榕小蜂协同进化内在机制的重要内容。本文解析了垂叶榕隐头花序伴随瘿花发育的5个发育时期，采用同工酶电泳的方法比较了瘿花与正常雌花同工酶（包括过氧化物酶、过氧化氢酶、淀粉酶和酯酶）谱带的差异，采用扫描电镜对比了瘿花壁与授粉后雌花子房壁的差异。结果表明，瘿花被榕小蜂产卵以后，至少启动了一个与消除过氧化物有关的酶；而且，瘿花子房壁结构疏松，内含物小而少，雌花子房壁结构致密且内含物多而大，说明瘿花发育所消耗的营养物质大于正常雌花发育的消耗。研究结果支持造瘿生物汇集营养与植物防御行为的互利假说。

关键词 垂叶榕；瘿花；同工酶；协同进化；假说

中图分类号 Q941 文献标识码 A

Abstract Fig trees （Ficus spp.； Moraceae） are pollinated by species-specific fig wasps （Agaoninae） and have long been held as the example system of co-evolution. In Ficus benjamina， five development phases of syconia are analyzed. We hope to explore the differences between female flowers and gall flowers. The development of gall flowers is the important key to understand the internal mechanism of fig/fig wasp co-evolution. Using an isozyme electrophoresis and scanning electron microscope， in female flowers and gall flowers， we compared the isozyme （including Amy， Pox， CAT and Est） zymogram. The structure differences in the ovary wall of female flowers and gall flowers were also compared. The result showed that a kind of Pox was activated at least when gall flowers was formed. Moreover， the structure of the ovary wall was loose， the inclusions were small and less； the ovary wall structure of the female flowers was dense， and the inclusions were large and more， indicating that there was more nutrition consumption in the development of gall flowers than that in the seed flowers. Based on these results， we hereby support the mutual benefit hypothesis in the gall-insect mutualism.

Keywords Ficus benjamina； gall flower； isozyme electrophoresis； co-evolution； hypothesis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.006

桑科榕屬植物（Ficus spp.）广泛分布于热带及亚热带地区。榕属植物具有特化的隐头花序（syconium），通常称为榕果或隐头果。隐头花序顶端由小孔苞片所形成孔道，只在特定时期让专一性的榕小蜂（fig wasp）进入授粉或提供部分雌花子房供小蜂产卵形成虫瘿，延续小蜂种群[1-3]。为维持这种互利关系，榕属植物及榕小蜂在形态及结构上高度特化，形成专一性的共生关系。二者相互依赖，互惠互利，是动植物间关系密切的共生伙伴。榕属植物与其传粉昆虫的这种互利共生关系，是研究植物和昆虫协同进化的模式系 统[1-3]。榕属植物可分为雌雄同株与雌雄异株两大类。雌雄同株的榕果内，雌花一部分被昆虫产卵发育为虫瘿，一部分被传粉而形成种子。雌雄异株的榕果，则有产生种子的雌榕果以及产生花粉与虫瘿的雄榕果之分。Hartley[4]曾比较了瘿组织和邻近正常组织的元素组成及次生代谢物，发现瘿组织具有较低水平的氮化合物和较高水平的酚类化合物。不同造瘿者在同一寄主上的造瘿组织的化学组成不同，同一种瘿瘤的不同发育阶段瘿组织的化学组成也不同，研究者认为造瘿者可能产生了某种专一性的活性物质，促使瘿组织的化学组成发生实时性的改变。

关于虫瘿形成的原因和虫瘿与植物的相互关系，许多学者提出不同的假说。Price等[5]将这些假说分成六类，分别是：中性共生（neutralism）的非适应性假说（nonadaptive hypothesis），属于植物的防御行为的植物防御假说（plant protection hypothesis），造瘿生物汇集营养与植物防御行为的互利假说（mutual benefit hypothesis），仅为造瘿生物汇集营养的营养假说（nutrition hypothesis），为躲避环境逆境的微环境假说（microenvironment hypothesis），为抵抗和躲避天敌的天敌假说（enemy hypothesis）。这些学说虽然可解释一种或几种类型虫瘿的形成，但总有不完善的地方。这些假说也从另一侧面反映了自然界虫瘿种类的多样性和复杂性。国内对榕属植物与传粉榕小蜂、非传粉小蜂之间的相互关系及共生维持机制已经开展大量研究[6-8]，但针对榕属植物隐头花序内的瘿花发育特性的研究至今报道较少[9-11]。

垂叶榕是我国南方常见的雌雄同株榕属植物，贾效成等[12]已鉴定其在广州地区的传粉小蜂为Eupristina koningsbergeri，3种非传粉小蜂分别是Epichrysomallinae sycobia sp.、Philotrypesis sp.1和Philotrypesis sp.2。为进一步阐明榕/蜂共生的生理生化过程，探索共生过程中的代谢活动，寻找隐头花序内榕/蜂共生关系中的虫瘿形成与一般虫瘿形成的异同点，本研究以垂叶榕为研究对象，介绍了垂叶榕隐头花序发育的5个时期，研究了垂叶榕雌花和瘿花发育初期过氧化物酶、过氧化氢酶、淀粉酶和酯酶的谱带差异，并观察了二者子房发育过程中子房壁的结构，旨在对榕属植物的瘿花发育特性有新的认识，为进一步揭示榕树/榕小蜂协同进化的内在机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 以垂叶榕隐头花序内的雌花

和瘿花为研究材料。垂叶榕主要分布在华南地区，为雌雄同株，其专一性的造瘿昆虫是垂叶榕小蜂（Eupristina koningsbergeri），属膜翅目榕小蜂科（Hymenoptera：Agaonidae），翅膀退化的雄蜂先行羽化，随即与虫瘿内的雌蜂交配后死亡。雌蜂羽化后，沾附花粉飞离榕果，寻找新的处于雌花期的榕果产卵。进入新榕果的小蜂可以在短花柱雌花上产卵形成虫瘿（瘿花），同时在长花柱雌花上传粉形成种子。在研究隐头花序发育时取自然条件下各时期的花序，置于体式显微镜Olympus（OLYMPUS SZ-CTV）下观察；在研究瘿花与雌花同工酶谱带时，在雌前期以80目的塑料网袋套住隐头花序，在雌花期人工放飞传粉小蜂进入网袋，排除非传粉小蜂的影响。

1.1.2 样地和样株 实验于2014年8月至2015年10月在中国科学院华南植物园（11318E，2306N）实施。位于广东省广州市，海拔20～327 m，年平均气温 21.8 ℃， 属于热带亚热带气候。以植物园8株垂叶榕为样株，观察取材。

1.2 方法

1.2.1 雌花与瘿花的同工酶分析 在间花期取长花柱雌花和瘿花为实验材料，同工酶分析参照王中仁[13]和孙新立等[14]的方法，并略有改进，具体实验参数见表1。

1.2.2 隐头花序发育的划分及拍照 根据Galil等[3]的方法将榕树隐头花序的发育周期分为5个时期。该分期标准被诸多学者所引用，具有合理性与权威性，是研究榕属植物瘿花发育公认的尺度。瘿花发育的典型特征于体视显微镜（OLYMPUS SZ-CTV）下观察并拍照（Nikon4500）。

1.2.3 瘿花与雌花的扫描电镜观察 在间花期取长花柱雌花和瘿花，用2%戊二醛常温固定4 h后磷酸缓冲液洗涤2 h（每次20 min，换洗6次），1%锇酸4 ℃固定12 h，2 h洗涤（每次20 min，换洗6次），再用依次30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精系列脱水，临界点干燥，样品用醋酸异戊酯处理30 min，样品常规方法粘台，JFC-1100离子溅射镀金，JSM-T300扫描电镜观察，拍照。

2 结果与分析

2.1 隐头花序的发育

如图1所示，垂叶榕隐头花序的發育共分5个时期，分别是：（1）雌前期（pre-female phase），花序芽开始发育并逐渐膨大，直至隐头花序内的雌花具有授粉能力之前。如图1-A所示，此时雄花尚未开始发育，短花柱雌花和长花柱雌花均已发育。该发育阶段历时较短，仅有3～5 d。（2）雌花期（female phase），从雌花具有授粉能力开始，至雌花接受花粉受精或被榕小蜂产卵。此时花序口的硬质苞片打开，榕小蜂通过花序口钻入花序腔进行产卵和传粉。此时长花柱雌花已经被榕小蜂产卵，短花柱雌花已经授粉，雄花亦开始发育， 如图1-B所示。（3）间花期（interfloral phase），此时受精或被产卵的雌花子房膨大，开始发育为种子或孕育榕小蜂幼虫的瘿花（gall flower），雄花继续发育，花序也开始膨大。榕小蜂幼虫在此期间逐渐发育直到成熟。如图1-C所示，该发育阶段历时较长，约3周时间。（4）雄花期（male phase），花序膨大并开始变的松软，苞片萎缩使花序通道打开。雄花发育成熟，花药开裂散发花粉。雌、雄榕小蜂由瘿花内钻出。如图1-D所示，该发育阶段较短，1～2 d。（5）花后期（postfloral phase），此时瘿花内的榕小蜂已经迁飞，种子成熟，雄花凋谢，如图1-E所示。花后期历时也较短，2～4 d。

2.2 雌花与瘿花的同工酶谱带比较

由图2可以看出，4种同工酶仅有过氧化物酶谱带清晰明显，另外4种同工酶均不能跑出清楚的谱带。在过氧化物酶谱带中，瘿花组织明显缺少一条小分子的谱带，证明瘿花被榕小蜂产卵以后，至少启动了一个与消除小分子过氧化物有关的酶。

2.3 雌花与瘿花的形态结构比较

如图3-A、B所示，长花柱雌花授粉后子房膨大明显，柱头呈羽片状；瘿花的子房被榕小蜂

产卵后膨大较小，花柱短而细，二者区分明显。图3-C、D显示了雌花和瘿花的子房壁整体形态，其中雌花的子房壁内含物明显较多，造成其切面粗糙；而瘿花的子房壁内含物较少，其切面光滑，空洞较多。进一步放大可见二者切面差异的细节，如图3-E、F箭头所示，雌花子房壁的细胞充满内含物，使细胞充实饱满，说明其营养充足；瘿花子房壁的细胞内含物少而小，细胞空洞较大，说明其营养消耗较大。

3 讨论

3.1 宏转录组测序所揭示的基因表达差异

Martinson等[9]以巴拿马的大叶榕（Ficus obtusifolia）为材料，采用宏转录组测序的方法研究了雌花和瘿花授粉前后的基因表达差异，发现产卵前的瘿花与授粉前的雌花相比，其与黄酮类及碳水化合物代谢相关的基因表达显著上调；而产卵24 h后的瘿花其与查耳酮合成酶和异构酶代谢相关基因表达显著上调。说明在该种雌雄同株榕树中，靠近花序腔的雌花与远离花序腔的雌花在授粉和被产卵前已经发生了功能上的初步分化，二者在雌花期的基因表达差异显著，使得榕小蜂倾向于产卵在含黄酮类和碳水化合物物质更多的雌花上；产卵后的瘿花在卵的刺激下，产生了更多的查耳酮类物质，使得瘿花开始形成。本研究在间花期取样，仅关注了过氧化氢酶、过氧化物酶、酯酶和淀粉酶，此时传粉小蜂幼虫和种子已经开始发育，其营养消耗的种类和幅度与上述研究相比已经发生很大变化，如糖类、酯类、黄酮类和查耳酮类物质等。另一方面，受上述研究启发，在雌花期和间花期初始阶段，可以重点分析与碳水化合物代谢、黄酮类代谢和查耳酮代谢相关酶活性的变化，这需要进一步研究。

3.2 雌花与瘿花组织的同工酶

植物在逆境条件下正常的氧代谢受阻，体内的活性氧含量会迅速积累，膜脂过氧化作用将导致膜系统受损，引起细胞膜的通透性增加及电解质的渗漏，最终会导致细胞死亡和组织被损坏，使得植物处于一种损伤状态[15]。汪少妃等[15]在研究刺桐姬小蜂成瘿过程时发现，受刺桐姬小蜂危害后受害叶片内保护酶[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）]活性显著提高，说明刺桐姬小蜂虫瘿的形成诱导刺桐的保护酶产生，表现出了明显的防御反应。虫瘿的形成显著提高了寄主叶片的SOD、CAT、POD、PPO活性；其中SOD、CAT、PPO活性主要体现在虫瘿组织上，开裂期酶活性均达到最大； PPO活性随虫瘿发育不断增加，而SOD、CAT活性分别在成熟期、成长分化期都有所下降，POD活性则主要表现在非虫瘿组织上。本研究发现，雌花与瘿花组织中4种同工酶仅有过氧化物酶谱带清晰明显，另外3种同工酶均不能跑出清楚的谱带。对于刺桐姬小蜂虫瘿形成的研究发现，在虫瘿的成长分化期其SOD、CAT、POD、PPO活性的测定值分别为200～300、15～20、2 500～4 000、50～80 U/mg prot。由此可推测，在本研究中由于过氧化物酶的含量很高，因此容易跑出清晰的谱带，而另外一些酶由于含量太少，难以跑出清晰的谱带。在今后的研究中可以考虑利用比色的方法测定含量少的酶的活性，这有待于进一步研究。

3.3 关于隐头花序的发育

Galil等[3]将榕树隐头花序的发育周期分为5个时期，本文对垂叶榕内部雌花和瘿花的发育研究发现，垂叶榕的隐头花序发育经历5个明显的

时期，这与其余榕属植物花序的发育过程相似[16]。花序发育过程中，雌花、瘿花和雄花形态区分明显，尤其是花柱的长度和花药，可以作为区分特征。另外研究中还发现，一些非传粉小蜂（non- pollinating wasp）在雌花的子房内产卵形成的瘿花特别大，如图1-E所示，最右边的瘿花即为非传粉小蜂寄生形成的瘿花，这可能与其幼虫体型较大，发育过程消耗更多的营养有关。由于非传粉小蜂的种类特别多[17]，产卵的时间差别很大，产卵的部位多样，其产卵造成的瘿花可能与传粉小蜂产卵造成的瘿花存在很多差异，这需要进一步研究。

3.4 造瘿昆虫对营养的消耗

虫瘿是造瘿昆虫发育的场所，幼虫主要有两种方式获得植物的营养，一种方式是营养截取，即在植物正常营养流向的通路上拦阻养分；另一个方式是营养汇集，即重新改造植物的营养流向，创造新的营养汇集库，把虫瘿四周的营养汇集起来。Wool等[18]以放射线同位素示踪的方法进行研究，发现瘿绵蚜在黄莲木属植物能创造营养汇集库，且营养汇集的强度与造瘿昆虫的种类及虫瘿的类型均有相关关系。有些虫瘿所汇集的营养从隔壁的芽枝转运而来，而有些蟲瘿营养汇集局限在同枝条的叶片、同叶片的小叶、或仅能获得同小叶的营养。本文研究的虫瘿存在于隐头花序中，榕小蜂的幼虫发育期间引起的营养汇集应主要来源于隐头花序，其营养是否亦来源于邻近叶片或邻近的雌花尚有待于进一步研究。

Jansen-Gonzalez等[19]通过组织切片的方法发现，对于主动传粉的雌雄同株榕属植物，其幼虫发育的前两个阶段寄生于子房，而后期则寄生于膨大的胚乳组织。本文的研究表明，在瘿花发育后期，组成瘿花的细胞空洞大而内含物少，其营养可能用于虫瘿幼虫发育。对于非主动传粉类型及非传粉小蜂产卵制造的虫瘿，其发育过程影响因素更多，尚需要进一步研究。

汪少妃等[20]研究表面，刺桐姬小蜂虫瘿的结构包括表皮层、保护层、薄壁层和瘿室4部分。其中，表皮层由表皮细胞和皮层组织构成，保护层主要由绿色的厚壁细胞以及一些含有液泡的软组织组成；薄壁层主要由薄壁细胞组成，且内层薄壁细胞解体，为虫体发育提供营养。虫瘿含有细胞壁薄而营养物质丰富的组织和大量维管组织，这直接影响了营养物质的产生和运输，使得虫瘿成为一个新营养库源，可为虫体生长发育提供营养。本研究通过扫描电镜发现，在间花期随着虫体发育，瘿花壁内侧存在大量解体破碎的细胞，这些细胞应为释放营养物质后解体的内层薄壁细胞；这些营养物质的组成和含量变化在瘿花的不同发育阶段差别很大，可能以碳水化合物、黄酮类、查耳酮类等为主，这需要进一步研究。

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