菠萝蜜白化突变体的性状研究

付影 于旭东 蔡泽坪 吴繁花 罗佳佳

摘 要 在野外考察中发现了菠萝蜜白化突变体，并对其形态和生理方面进行了研究。通过分光光度计法、离体称量法、比色法等比较研究菠萝蜜实生白化苗与正常苗在形态指标和生理指标方面的差异。结果表明：菠萝蜜白化突变体的株高、侧根密度、茎粗、叶柄长、叶片长、叶片宽、叶面积、叶周长、叶绿素含量均低于正常苗，而含水量、蒸腾速率、脯氨酸含量均高于正常苗。菠萝蜜白化突变体和正常苗无论在形态还是生理上都有很大的差别。本研究不仅为木本经济作物白化突变体的研究提供材料，而且为进一步研究菠萝蜜白化苗的形成机制提供参考依据。

关键词 菠萝蜜；白化突变体；形态指标；生理指标

中图分类号 S667.8 文献标识码 A

Characters of Albino Mutant of Artocarpus heterophyllus Lam.

FU Ying1， YU Xudong1， CAI Zeping1*， WU Fanhua1， LUO Jiajia1，2

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737， China

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract An albino mutant of Artocarpus heterophyllus Lam. was discovered in field investigation， and its morphological and physiological aspects were studied. The differences between the morphological indexes and physiological indexes of A. heterophyllus were studied by spectrophotometry， vitro weighing method and colorimetric method. The results showed that plant height， lateral root density， stem diameter， petiole length， leaf length， leaf width， leaf area， leaf perimeter， chlorophyll content and of the albino mutants were lower than those of normal seedlings. However， the transpiration rate and proline content of the mutant were higher than those of the normal seedlings. There were big differences in morphology and physiology of the albino mutants and normal seedlings. This experiment not only provides materials for the study of albino mutant of woody economic cro ps， but also provides reference for further study on the formation mechanism of albino seedlings of A. heterophyllus.

Key words Artocarpus heterophyllus Lam.； albino mutant； morphological index； physiological index

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.007

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）又称木菠萝、树菠萝，桑科（Moraceae）木菠萝属（Artocarpus）常绿乔木。菠萝蜜是集水果鲜食、木本粮食和珍贵木材于一体的经济作物，是世界著名的热带果树[1]。近年来对菠萝蜜果实加工研究较多，但生理和形态方面的研究较少，且白化突变体的形态、生理和分子生物学研究均未见报道。白化苗是一种植物的变异，是科学研究的特殊材料，但白化现象会造成农林生产上的损失[2]。因此白化苗的形成机理及分子机制受到了国内外科研人员的广泛关注和研究。已有报道在许多植物的实生苗以及组培苗中发现白化现象，比如版纳省藤（Calamus nambariensis Becc. var. xishuangbannaenis S.J.Pei et S.Y.Chen）、苦瓜（Momordica charantia L.）、水稻（Oryza sativa L.）、花生（Arachis hypogaea L.）、玉米（Zea mays L. Sp.）、豌豆（Pisum sativum L.）、椰子（Cocos nucifera L.）、苏铁（Cycas revoluta Thunb.）、桢楠（Cycas revoluta Thunb.）、斐济贝壳杉[Agathis macrophylla （Lindl.） Mast.]、印度八角枫（Alangium lamarckii Thwaites）等植物[2-12]。

与草本植物相比，木本植物生长周期长，突变体研究较为困难，白化突变体的研究更少。此次笔者在野外首次发现菠萝蜜白化突变体，并对比分析其与正常苗形态和生理指标的差异，为进一步研究菠萝蜜白化苗的形成机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为白化和正常的菠萝蜜幼苗，均采自海南省儋州市，每株苗带有完整的根、茎、叶，保湿带回实验室，进行指标测量。仪器主要有光学显微镜、电子分析天平、电热恒温干燥箱和分光光度计等。

1.2 方法

1.2.1 形态学观察 根、茎、叶形态测量：测量以下指标：主根长、侧根密度、株高、茎粗、叶柄长、叶片长、叶片宽、叶面积、叶周长等，重复3次，计算各指标的平均值和标准差。叶各项指标测量均选择幼苗中最大的一枚叶。

叶表皮的显微结构观察：分别剥取叶的上、下表皮放在清洁的载玻片上，制成水封临时装片， 进行显微观察，选择清晰的图像，显微摄影。测量并记录的指标包括上下表皮扁平细胞（pavement cell）面积与数量、突出（Lobe）数、Lobe长、颈（neck）宽、气孔器密度（stomatal density）、气孔器数量、气孔器指数（stomatal index）等，气孔密度=单位面积内气孔数量/面积（mm2）。气孔指数=单位面积内气孔数量/（单位面积内气孔数量+单位面积内表皮扁平细胞数）×100%。重复6次，数值以“平均值±标准差”表示。

1.2.2 生理指标测定 叶绿素含量测定：取新鲜叶片，参照张志良[13]的方法提取叶绿素。将叶绿素提取液在波长663、645 nm下测定吸光度，每个样品重复3次。利用Arnon法公式计算叶绿素含量[14]。

含水量测定：剪下根、茎、叶和子叶后立即称鲜重；分别装入洁净干燥的自封袋，放入烘箱，恒温60 ℃烘至恒重。烘干后立即称重，得到根、茎、叶和子叶的干重，每个样品重复3次。相对含水量（relative water content，RWC）的计算公式：

RWC=（鲜重-干重）/鲜重×100%。

蒸腾速率测定：取新鲜叶片，参照刘萍等[15]提出的离体测量法测定蒸腾速率，每个样品重复3次。

脯氨酸和可溶性糖含量测定：取新鲜植株，参照李合生[16]提出的比色法分别测定脯氨酸含量和可溶性糖含量，每个样品重复3次。

1.3 数据处理

试验数据的统计和分析均采用SPSS 19.0和Excel 2010软件，采用LSD检验和Duncan法进行数据差异显著性多重比较。

2 结果与分析

2.1 白化突变体自然生长情况

对发现白化苗的母树（正常）下的幼苗进行统计，总共发现39株幼苗，其中白化苗10株，占全部苗的25.6%（图1）。将白化苗移栽到含有营养土的花盆中放入温室大棚培养，发现白化现象并无改变，说明白化现象的产生不是环境造成的，可能是由于基因突变或叶绿素合成受阻等造成的。

2.2 形态学分析

2.2.1 根、茎和株高的形态学比较 菠萝蜜白化突变体幼苗的株高[（364.67±62.20） mm]比正常苗[（457.36±18.56） mm]矮（图2-A）。虽然其主根长[（176.45±41.23） mm]與正常苗[（196.23±26.71） mm]相当，但侧根密度[（2.40±0.29）个/mm]小于正常苗[（3.75±0.63）个/mm]，差异极显著（图2-A、B）。同时，突变体的茎较为瘦弱（图2-C）。

2.2.2 叶的形态学比较 菠萝蜜白化突变体叶柄长、叶片长和叶片宽均小于正常苗，分别是正常苗的47.2%、45.7%和41.2%，差异极显著；突变体叶面积和叶周长均小于正常苗，但叶周长/叶面积大于正常苗，是正常苗的近3倍，差异极显著；在叶片长/叶柄长与叶片长/叶片宽中，突变体（11.45±1.12与2.00±0.17）与正常苗（12.08±1.88与1.79±0.23）相比差异不显著；由此可见，叶形差异不大，但尺寸显著缩小了（表1，图1）。

2.2.3 叶表皮扁平细胞和气孔器的形态学分析 叶表皮扁平细胞比较：突变体表皮扁平细胞较小，上、下表皮扁平细胞面积均约为正常苗的1/3，而其密度分别是正常苗的4倍和2.5倍，差异极显著（图3-B、D，表2）。突变体表皮扁平细胞边缘弯曲较少，Lobe数目减少而且Lobe的长度变短，上、下表皮扁平细胞的Lobe数分别是正常苗的78.3%和63.8%，Lobe长度分别为正常苗的53.2%和74.5%，差异均极显著；上下表皮扁平细胞Neck宽度分别为正常苗的60.9%和81.8%，差异极显著（图3，表2）。

气孔器比较：菠萝蜜气孔器由2个肾形的保卫细胞（guard cells）组成，没有副卫细胞（accessory cells）。突变体与正常苗上表皮均没有气孔的分布，气孔器只存在于下表皮。突变体气孔面积发生变化，气孔的长宽减小，气孔指数减小，气孔面积（stomatal area）是正常苗的67.7%，气孔的长和宽分别为正常苗的78.0%和89.4%，气孔长宽比为正常苗的82.9%，差异极显著。气孔指数是正常苗67.1%，差异极显著。而气孔密度大于正常苗，是正常苗的1.6倍（图3-B、D，表3）。

2.3 生理指标分析

2.3.1 含水量比较 从表4可知，突变体整个植株的含水量高于正常苗，叶片、茎和子叶的含水量均大于正常苗，差异极显著；而根含水量与正常苗相当，无明显差异。

2.3.2 叶蒸腾速率（Tr）和叶绿素含量（Chl）比较 白化突变体叶绿素含量发生变化，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量接近0，远小于正常苗（表5）；蒸腾速率[（77.51±7.81） g.m-2.h-1]比正常苗[（48.15±7.95） g.m-2.h-1]高60%，差异极显著（图4-A）。

A：正常苗叶片上表皮细胞；B：正常苗叶片下表皮细胞；C：突变体叶片上表皮细胞；D：突变体叶片下表皮细胞；标尺为50 μm。

A： Upper epidermis cells of normal leaves； B： Lower epidermis cells of normal leaves； C： Upper epidermis cells of mutant leaves； D： Lower epidermis cells of mutant leaves； The scale is 50 μm.

2.3.3 可溶性糖和脯氨酸（Pro）含量比较 突变体脯氨酸含量[（145.75±6） μg/g]极显著高于正常苗[（38.38±5） μg/g]，是正常苗的近4倍（图4-B）；但突变体可溶性糖含量[（0.240±0.014） g/hg]与正常绿苗相比[（0.255±0.021） g/hg]无明显差异（图4-C）。

3 讨论

叶表皮主要由表皮扁平细胞、气孔保卫细胞（Stomatal guard cell）和表皮毛（Trichrome）3类细胞构成[17]。表皮原始細胞沿叶长轴扩展，形成变长的多边形细胞；细胞开始产生向外的生长点（Outgrowths），或沿着细胞壁的背斜面向相邻细胞侧面延伸形成多处Lobes，Lobes和Necks进一步的延伸，最终形成相互交错的表皮扁平细胞[18]。菠萝蜜白化突变体与正常苗相比，整体长势较弱。其侧根密度、株高、茎粗、叶柄长、叶片长、叶片宽、叶面积、叶周长、叶绿素含量等都低于正常苗。叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，叶绿素含量大小直接决定叶片光合能力的强弱[19]。白化苗中含有微量的叶绿素，而不是人们普遍认为的白化苗不含叶绿素，但是其叶绿素含量远低于正常苗，含量近乎0。Bae等[20]在烟草白化苗中检测出微量叶绿素，与本研究结果一致。白化苗叶绿素含量非常低，光合作用极弱，只能依靠子叶提供营养。突变体不能进行正常的光合作用，可能是导致突变体生长势（growth vigor）弱的重要原因。

植物一方面从土壤中吸收水分，另一方面又向大气中蒸腾散失水分。蒸腾作用在响应土壤水分胁迫时是判断植物抗旱性强弱的一项重要参数[21]。叶片是植物进行同化与蒸腾作用的主要器官，也是植物对干旱胁迫最敏感的器官。叶片上的气孔是植物与外界环境之间水、气交换的主要通道，直接控制蒸腾强度。实验结果表明，突变体叶片的水分散失速率比正常苗高60%。这与突变体叶片气孔密度比正常苗高60%相互印证。然而突变体植株含水量明显高于正常苗，这可能与植物体内脯氨酸、可溶性糖等溶质的含量有关。

脯氨酸在动物、植物、真菌、藻类中均有积累，是已知的在植物中分布最广的渗透保护物质。在非生物胁迫条件下，植物的生长发育受到不同程度的影响。许多实验证明脯氨酸的累积能够提高植物对环境胁迫的耐受力[22-23]。菠萝蜜白化突变体脯氨酸的含量明显高于正常苗，是正常苗的近4倍。说明突变体受环境胁迫程度深，可能与白化苗的生长发育不良有关，而长势较好的正常苗脯氨酸含量较低。脯氨酸含量还与植物体内水分状况的变化关系十分密切[24]。脯氨酸与细胞内的一些化合物形成聚合物，类似亲水胶体，有一定的保水作用，可能也是植株含水量高于正常苗的重要原因。

糖是代谢的中间产物或终产物，调节植物的生长、发育等多个生理过程，参与胞内信号调节和转导过程，在植物生长、发育、成熟和衰老等过程中发挥调控作用[25]。可溶性糖是光合作用的产物，在一定程度上反映光合产物的积累和运转情况[26]。由于突变体不能进行正常的光合作用，主要依靠从种子中吸收的营养维持生命活动。突变体的可溶性糖含量与正常苗差别不大，说明此时的菠萝蜜白化苗还能通过子叶提供的营养物质继续生长。

本研究结果表明，白化苗的整体长势弱于正常苗，可能与白化突变体叶绿素含量低，不能进行正常的光合作用有关。白化突变体生长发育不正常导致脯氨酸含量高于正常苗。菠萝蜜白化突变体的形成机制还需要进一步的研究，研究白化突变体的成因进而控制其形成也是当前作物育种中亟待解决的一个问题。

参考文献

[1] 葛 宇，丁哲利，林兴娥，等. 菠萝蜜研究进展[J]. 中国南方果树，2015，44（5）：141-146.

[2] 李荣生，尹光天，许煌灿，等. 版纳省藤实生白化苗与正常苗的比较研究[J]. 林业科学研究，2004，17（6）：819-823.

[3] 刘振昌，王莉青. 苦瓜白化苗生长发育调查分析[J]. 安徽农业科学，2016，44（34）：140-141.

[4] Zhang Y，Zhu D，Chen H，et al. Effects of biuret on seedling rate and albino seedling of rice[J]. China Rice，2017，23（2）：10-12.

[5] Coffelt T A，Hammons R O. Inheritance of an albino seedling character in Arachis hypogaea L.[J]. Crop Science，1971，11（5）：753-755.

[6] 何永梅. 玉米幼苗白化苗的识别与防治措施[J]. 农药市场信息，2012（10）： 43.

[7] 赵 鑫，刘红霞，陈佰鸿，等. 豌豆白化苗蛋白质双向电泳技术的建立[J]. 生物技术通报，2010（10）：100-103.

[8] Cao H X，Chen L Q，Sun C X，et al. Difference of some morphologic and physiological indexes of green and albino seedling of coconut[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2009，22（2）：304-307.

[9] 黄志明. 苏铁白化苗叶片形态与结构观察[J]. 亚热带植物科学，2003，32（1）：33-35.

[10] 张 炜，陈 忠，龙汉利，等. 基于AFLP技术对桢楠实生白化苗与正常苗的比较研究[J]. 四川林业科技，2014，35（4）：9-12.

[11] 黄小萍. 斐济贝壳杉白化苗与正常苗形态及生理特性比较[J]. 亚热带植物科学，2017，46（1）：20-24.

[12] Ahirwar J R. Occurrence of albino seedlings in Alangium lamarckii[J]. The Indian Journal of Agricultural Sciences，2015，141（1）：116-117.

[13] 张志良. 植物生理学实验指导（第二版）[M]. 北京：高等教育出版社.

[14] 程玉鵬，马爱萍，王洪月，等. 龙胆愈伤组织中叶绿素的含量测定[J]. 化学工程师，2017，31（4）：25-27.

[15] 刘 萍，李明军. 植物生理学实验技术[M]. 北京：科学出版社，2007.

[16] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[17] Larkin J C，Marks M D，Nadeau J，et al. Epidermal cell fate and patterning in leaves[J]. Plant Cell，1997，9（7）：1 109-1 120.

[18] Fu Y，Li H，Yang Z. The ROP2 GTPase controls the formation of cortical fine F-actin and the early phase of directional cell expansion during Arabidopsis organogenesis[J]. Plant Cell，2002，14（4）：777-794.

[19] 王仁雷，华 春，刘友良. 盐胁迫对水稻光合特性的影响[J]. 南京农业大学学报，2002，25（4）：11-14.

[20] Bae C H，Abe T，Matsuyama T，et al. Regulation of chloroplast gene expression is affected in ali，a novel tobacco albino mutant[J]. Annals of Botany，2001（4）：545-553.

[21] 万素梅，贾志宽，杨宝平. 苜蓿光合速率日变化及其与环境因子的关系[J]. 草地学报，2009，17（1）：27-31.

[22] Bai J，Mao J，Yang H，et al. Sucrose non-ferment 1 related protein kinase 2 （SnRK2） genes could mediate the stress responses in potato （Solanum tuberosum L.）[J]. BMC Genet，2017，18（1）：41.

[23] Ankita S，Surinder K S，Alok K，et al. Proline content and membrane permeability index inm response to water stress in recombinant inbred lines of lentil[J]. Vegetos-An International Journal of Plant Research，2017，30（2）：63-72.

[24] 彭运翔，李淑君，张 力. 6种披碱草叶片脯氨酸含量、蒸腾强度与含水量的关系[J]. 内蒙古林业科技，2000，26（4）：26-29.

[25] Koch K E，Ying Z，Wu Y，et al. Multiple paths of sugar-sensing and a sugar/oxygen overlap for genes of sucrose and ethanol metabolism[J]. Journal of Experimental Botany，2000，51（S1）：417-427.

[26] 胡珍兰，张海伟，胡承孝，等. 钼氮配施对烤烟光合作用及可溶性糖含量的影响[J]. 华北农学报，2014，29（3）：199-203.