混栽对主栽作物茄子根际土壤微生物生态学特性的影响

姚华开 张传进 刘岳飞 吴人敏 杨尚东

摘 要 探索构建微生物多样性丰富根际微环境的方法，为生态防控连作障碍提供理论依据与技术支撑。选取茄子为主栽作物，苋菜、薄荷、芥菜、韭菜、菜豆等匍匐生长或矮生的蔬菜种类为混栽组合，采用传统分析方法和现代高通量测序技术，分析混栽对主栽茄子根际土壤肥力及细菌多样性的影响。结果表明：混栽组合茄子根际土壤中可培养微生物数量（细菌、真菌、放线菌），涉及碳、氮、磷循环相关酶的活性以及微生物生物量（碳、氮、磷）等指示土壤肥力与健康状况的生物学指标，均优于单一种植的对照；另一方面，基于高通量测序技术分析发现，混栽组合茄子根际土壤中细菌的多样性指数（H）、丰度（S）和均匀度指数（Eh）均显著高于对照。上述茄子混栽组合种植均能有效地提高主栽作物茄子根际土壤肥力和细菌多样性。其中，茄子-菜豆和茄子-韭菜组合对提高茄子根际土壤肥力和细菌多样性的效果尤为显著。

关键词 茄子；套种；高通量测序；细菌多样性

中图分类号 S641.1 文献标识码 A

Effects of Intercropping on Soil Characteristics of Microbial Ecology in Rhizosphere of Eggplant

YAO Huakai1，ZHANG Chuanjin1， LIU Yuefei1， WU Renmin1，YANG Shangdong1，2*

1 Agricultural College， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China

2 Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract To reduce the harm of continuous cropping obstacle， a bio-control method via building high microbial diversity in the rhizosphere of crops was explored. Eggplant （Solanaceae melongena L.） was selected as a main crop and amaranth （Amaranthus tricolor Linn.）， mint （Mentha haplocalyx Briq.）， mustard（Brassica Juncea Coss.）， leek（Allium tuberosum Rottler ex Prengel.）and kidney beans（Phaseolus vularis L.）， which belonging to low-growing or creeping plants， were selected as the associated plants， respectively. Based on modern and traditional analyzed techniques， the effect of intercropping on soil fertility and bacterial diversity in the rhizosphere of eggplant were analyzed. The results showed that bio-indicators of soil fertility， such as the amount of cultivable microorganisms （bacteria， fungi， actinomycetes）， enzyme activities and microbial biomass， which related to carbon， nitrogen and phosphorus cycles in soils of intercropping treatments， were all higher than those of the control. In addition， the indexes of soil bacterial diversity （H）， abundance（S） and richness in the rhizosphere of eggplant also could be improved by intercropping treatments. It indicates that soil fertility and bacterial diversity in the rhizosphereof eggplants could be enhanced via intercropping methods， of which， kidney bean and leek are the most effective associated plants of eggplant.

Key words eggplant； intercropping； high throughput sequencing； bacterial diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.005

随着人们健康意识的加强，蔬菜消费量逐年增加。截止至2016年，我国蔬菜（含西甜瓜，下同）总播种面积达2 548.8万hm2，产量91 834.9萬t，总产值首次突破2万亿元。其中设施蔬菜的播种面积、产量和产值分别占21.5%、30.5%和62.7%[1] 。由于现代农业的发展讲究土地的高度集团化经营，其特点是用设施栽培、复种指数高、作物种类单一，加之菜农追求高收益以及当地的种植习惯，不愿意轮换种植不同种蔬菜，导致蔬菜生产中病虫害危害严重、产量和品质下降等设施盐渍化和连作障碍的发生[2-3]。微生物多样性是指微生物在遗传、种类和生态系统层次上的变化，在本质上源于遗传的多样性，即主要由碱基排列顺序的多样性和碱基数量的巨大性所决定[4]。土壤是微生物的大本营，微生物在土壤养分转化与腐殖质形成过程中有着重要的作用。土壤中微生物的多样性受耕作方式、地理位置、土壤层次、植被、土壤肥力、气候变化及土壤类型等诸多因素的影响。与之相反，土壤微生物的多样性又影响土壤生态系统的结构、功能及过程，是维持土壤生产力的重要组分[5]。

土壤微生物性状随土壤质量变化而发生变化，是指示土壤质量变化最敏感的生物指标[6-7]，同时也是土壤健康的决定性因素[8]。杨智仙等[9]研究表明云麦与蚕豆间作提高根际微生物活性和多样性，控制蚕豆枯萎病的发生。毛如志等[10]研究表明，玉米与马铃薯间作显著影响根际微生物的代谢群落的多样性及物种多样性及活力，间作增加玉米根际土壤微生物代谢多样性与细菌多样性。宋雅娜等[11]研究表明，间作能够促进不同作物根际细菌群落结构多样性增加并改变其群落结构，且间作的影响第3年比第2年更明显，玉米/蚕豆的间作体系对作物根际氨氧化细菌群落的作用更为明显。彭化贤等[12]研究表明间栽和混播技术都能持续有效地控制和降低小麦条锈病的危害，对作物产量也有较大的提高。白雪慧等[13]研究表明，魔芋与玉米间栽会影响魔芋根际微生物群落功能，可誘导某些有益微生物群落的增长，降低魔芋软腐病的的发病率。

本研究以选取茄子为主要研究对象，苋菜、薄荷、芥菜、韭菜、菜豆等矮生或匍匐生长的作物为混栽组合。通过混栽不同科属的蔬菜，采用传统和高通量测序技术，分析混栽对主栽作物茄子根际土壤肥力及土壤细菌多样性的影响，探索克服连作障碍发生的生物学方法，为生态防控连作障碍提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

选取的材料为‘紫红长茄、‘红叶苋菜、‘安吉清甜芥菜、‘791大叶韭菜、‘菜豆的种子均购于广西南宁市蔬菜种子市场，其中薄荷于花卉市场购买幼嫩枝条扦插繁殖幼苗备用。

本试验于2016年在广西大学农学院蔬菜生产基地（东经108?18，北纬22?51.2）进行。选取优质的育苗基质，于温室大棚中育苗。试验设置6个处理：（A）单独种植茄子；（B）茄子-菜豆组合；（C）茄子-苋菜组合；（D）茄子-芥菜组合；（E）茄子-韭菜组合；（F）茄子-薄荷组合；移栽定植时以茄子为圆心，0.25 m为半径，圆周周围同时均匀种植混栽蔬菜组合。种植方式如图1所示；试验采用随机区组设计，种植小区分布如图2所示，每个小区面积约7.2 m2。

定植菜园土壤pH 5.50，有机质含量6.20 g/kg，全氮0.86 g/kg，全磷0.54 g/kg，全钾14.5 g/kg、碱解氮57.3 mg/kg，速效磷3.56 mg/kg，速效钾80.6 mg/kg。试验期间除草灌溉、病虫害防治等管理措施按常规方法进行相同管理。

定植60 d后进入成熟采收期时随机采样，即随机拔取每个处理中的主栽作物—茄子，采用抖根法采集根际土壤，每个小区中的5个处理均匀收集根际土壤，混匀，无菌袋收集。带回实验室后，将每份土壤样品分为3部分：一部分室内自然风干后过40目筛，用于土壤理化性状测定；另一部分过10目筛后，置于4 ℃冰箱保存，用于土壤生物学性状分析；第3部分过10目筛后，混合3次重复的土样，得6份样品，置于-80 ℃冰箱保存，用于细菌群落结构分析。

1.2 方法

1.2.1 土壤生物学性状分析 土壤中C、N、P循环相关酶β-葡糖苷酶（β-glucosidase）活性测定采用Hayano[14]的方法，氨肽酶（Aminopeptidases）活性测定采用Ladd[15]的方法，磷酸酶（Phosphatase）活性测定采用Tabatabai等[16]的方法。

微生物生物量碳测定采用氯仿熏蒸提取容量分析法；微生物生物量氮测定采用氯仿熏蒸提取茚三酮比色法；微生物生物量磷测定采用氯仿熏蒸提取全磷测定法，均参考李振高等[17]的方法。

土壤可培养微生物数量测定采用稀释平板法，其中细菌培养采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，真菌培养采用马丁氏琼脂培养基，放线菌培养采用改良高氏一号琼脂培养基。

1.2.2 土壤细菌群落结构分析 土壤细菌群落结构分析由上海美吉生物医药科技有限公司测序完成，测序具体类型与序列见表1。

测序具体流程：（1）DNA 抽提和PCR扩增：根据E.Z.N.A.? soil试剂盒 （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F （5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和806R （5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3） 引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min （PCR仪：ABI GeneAmp? 9700型）。扩增体系为20 μL，4μL 5*FastPfu 缓冲液，2μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。（2）Illumina Miseq测序：使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，UnionCity，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluor?-ST （Promega，USA）进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（Illumina，San Diego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300的文库。（3）构建文库步骤：a连接“Y”字形接头；b使用磁珠筛选去除接头自连片段；c利用PCR扩增进行文库模板的富集；d氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。（4）利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始数据上传至NCBI数据库中比对。

1.3 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 18.0统计软件对试验数据进行统计分析，平均数据用“平均数±标准差（S.D.）”表示，利用生物公司提供的云数据分析平台I-sanger进行在线数据分析，并且进行多样性分析、构建物种组成群落图和多样性分析距离Heatmap图。同时分析不同蔬菜混栽组合对细菌群落结构的影响。

2 结果与分析

2.1 不同蔬菜混栽组合茄子根际土壤的生物学性状

2.1.1 不同蔬菜混栽组合茄子根际土壤可培养微生物数量 由表2可知，蔬菜混栽组合茄子根际土壤中可培养微生物数量均显著高于对照。其中，可培养细菌数量以茄子-菜豆组合为最高，其次为茄子-韭菜组合，分别为对照的2.72、2.43倍，同时这2个组合处理茄子根际土壤中可培养细菌数量亦显著高于其它组合处理。另外，茄子-苋菜，茄子-芥菜，茄子-薄荷组合茄子根际土壤中的可培养细菌数量亦显著高于对照，分别为对照的2.15、2.11、2.11倍，但三者之间无显著差异。同样地，可培养真菌数量亦以茄子-菜豆组合为最高，约为对照的3.90倍，其次是茄子-薄荷组合，为对照的2.06倍，而且这2个组合处理茄子根际土壤可培养真菌数量亦显著高于其它组合处理；虽然茄子-苋菜、茄子-芥菜和茄子-韭菜组合亦显著高于对照，分别为对照的1.15、1.40、1.26倍，但三者之间无显著差异。可培养放线菌数量则表现出与可培养细菌数量完全相同的变化趋势，但各个混栽组合处理对可培养放线菌数量的影响比可培养细菌数量更为显著，如茄子-菜豆组合中茄子根际土壤的可培养放线菌数量为对照的13.14倍，而茄子-韭菜组合为对照的7.29倍，远高于混栽组合茄子根际土壤中可培养细菌数量与对照之间的倍数。

2.1.2 不同蔬菜混栽组合茄子根际土壤酶的活性 由表3可知，不同蔬菜混栽組合处理茄子根际土壤中涉及碳、氮、磷循环的相关酶活性大部分组合处理均表现出高于对照的趋势。其中，β-葡糖苷酶活性以茄子-菜豆组合为最高，其活性不仅显著高于对照，是对照的3.76倍，而且显著高于其它组合处理；磷酸酶活性以茄子-薄荷为最高，但其与茄子-菜豆组合之间并无显著差异，2个组合处理的磷酸酶活性分别为对照的1.54倍和1.53倍，而且与其它组合处理之间，除茄子-芥菜组合外均存在显著差异。涉及土壤氮循环相关酶活性之一的氨肽酶活性亦表现出与β-葡糖苷酶活性相类似的变化趋势，即茄子-菜豆组合中茄子根际土壤氨肽酶活性不仅显著高于对照，而且除茄子-韭菜组合外，均显著高于其它混栽组合处理。综上所述，蔬菜的混栽均不同程度地提高了主栽作物茄子根际土壤的酶活性，其中尤其以茄子-菜豆组合的提升作用最强。

2.1.3 不同蔬菜混栽组合茄子根际土壤的微生物生物量 由表4可知，不同蔬菜混栽组合中茄子根际土壤微生物生物量碳、氮和磷均显著高于对照。其中，微生物生物量碳以茄子-菜豆组合为最高，茄子-薄荷组合最低，但茄子-菜豆组合对微生物生物量碳的影响与茄子-韭菜和茄子-苋菜之间并无显著差异；不同蔬菜混栽组合对茄子根际土壤微生物生物量氮的影响同样显著提高了茄子根际土壤的微生物生物量氮，其中，提升效果以茄子-薄荷组合为最高，但其与茄子-菜豆组合之间并无显著差异。微生物生物量磷对不同蔬菜混栽的响应与微生物生物量碳的变化趋势相仿，各个混栽处理均显著高于对照，而且提升效果亦以茄子-菜豆组合为最高，表明不同蔬菜混栽组合均有助于提高主栽茄子根际土壤的微生物生物量碳、氮、磷，但综合提升效果以茄子-菜豆组合为最佳。

2.2 微生物群落多样性分析

由表5可知，基于高通量测序技术，6个处理样品得到的序列数都在3万条以上，6个样品中产生的OTU总数量为1 852条。其中A、B、C、D、E、F分别为1 504、1 593、1 549、1 538、1 584、1 545。其中OTU数量最多的是茄子-菜豆（B样品），为1 593个，最少的是对照（A样品），为1 504个；本次研究共获得的细菌群落共35个门，81个纲，149个目，253个科，403个属，773个种。另一方面，97%的研究水平上，通过云分析平台计算出各个样品的丰富度、均匀度、多样性指数等。Chao或ACE是用来衡量群落丰富度的指数，指数越大，说明群落丰富度越高。由表5可知，ACE指数和Chao指数的排列顺序均为：茄子-菜豆组合>茄子-韭菜组合>茄子-薄荷组合>茄子-芥菜组合>茄子-苋菜组合>茄子对照。均匀度和多样性指数亦是描述土壤细菌群落结构多样性的重要指标。选取Smithwilson指数衡量土壤细菌群落均匀度，发现不同混栽组合处理中Smithwilson指数的高低顺序与表征丰富度特征的Chao指数和ACE指数排列顺序不一致，但各个混栽组合中的Smithwilson指数均高于对照。此外，选取Shannon指数衡量土壤细菌群落多样性特征，同样发现不同混栽组合茄子根际土壤中Shannon指数均高于对照，而且亦以茄子-菜豆为最高，然后依次分别为茄子-韭菜、茄子-芥菜、茄子-苋菜和茄子-薄荷。

2.3 优势菌群结构分析

2.3.1 基于门分类水平的优势菌群分析 由图3可知，每个样品基于门分类水平上的细菌群落数量均达到了12个，表现出较高的多样性特征。其中，不同处理茄子根际土壤中分布的主要菌群有7个大门类，分别为Proteobacteria（变形菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Chloreflexi（绿弯菌门）、Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Nitrospirae（硝化螺旋菌门）和Actinobacteria（放线细菌门），其中变形菌门和酸杆菌门为优势菌群表现得尤为显著，6个处理样品中两者的合计所占比例均大于50%。此外，每个处理根际土壤样品中还有3.81%～5.1%的细菌在目前的分类研究水平中仍无法分类到任何一个已知的菌门中。

2.3.2 基于属分类水平的优势菌群分析 基于属分类水平上对6个处理茄子根际土壤样品进行分析，得出如图4所示的结果。6个混栽组合处理样品中发现的已知细菌共有403个属，其中A、B、C、D、E、F各个混栽处理样品中的属分类水平数目分别为：356、363、350、365、365、359。其中，相对丰度大于1%的有10个属，分别为：Rhodanobaeter（产黄杆菌属）、Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）、Nitrospira（硝化螺菌属）、Polaromonas、Lysobacter（溶杆菌属）、Flavobacterium（黄杆菌属）、Arenimonas（沙单胞菌属）、Cellvibrio（纤维弧菌属）、Dyella和Roseiflexu（玫瑰弯菌属）。

另一方面，由表6可知，在属分类水平上，相对丰度大于1%的未知细菌主要有：Latescibacteria、Anaerolinea（厌氧绳菌属）、Xanthomonas（黄色单胞菌属）、Nitrosomonas（亚硝化单胞菌属）、Acidohacteria（酸杆菌属）、Sparospiraceae、Chitinophagaceae、Rhodospirillum（红螺菌属）、Gemmatimonas（芽单胞菌属）、Blastocatellaceae、Gaiellales、Xanthobacter（黄色杆菌属）、NB1-j、TRA3-20、SC-I-84、TK10、KD4-96、OM19、H16、RB41、11-24等21个种属。上述属分类水平中，选取相对丰度1%为临界范围，低于1%各类菌属合并作为Other显示。此外，基于物种聚类结果发现，不同混栽组合处理中茄子根际土壤样品细菌的丰度总体较高，而且不同处理之间存在明显的差异性。

2.3.3 样本比较分析图 分析不同混栽组合处理中两两样品之间的相互距离，获得如图5所示的矩阵图。其中，不同样品之间的距离用一定颜色梯度进行表示（图5中右侧为颜色梯度代表的数值），图5中相似颜色区域表示两者之间距离的大小，而距离越大表示二者之间的差异也越大。与对照相比，发现茄子-菜豆组合与其之间的距离为0.309 4；茄子-苋菜组合与其之间的距离为0.262 6；茄子-芥菜组合与其之间的距离为0.258 4；茄子-韭菜组合与其之间的距离为0.246 8；茄子-薄荷组合与其之间的距离为0.225 1。此外，不同混栽组合之间除茄子-苋菜组合、茄子-芥菜组合和茄子-韭菜组合之间差异较小外，茄子-菜豆和茄子-薄荷与其它混栽处理组合间均存在着不同程度的差异。表明不同蔬菜的混栽组合，均有效地影响了主栽作物茄子根际土壤细菌的群落结构，形成了细菌多样性显著差异的根际微环境。

3 讨论

土壤微生物与植物在根际微环境中进行着复杂频繁的互作[19]。根际微生物与植物生有着密切的关系，对植物生长具有十分重要的作用[20]，同时对植物生产力以及农业生态系统功能都有着很大的影响作用[21-22]。

本研究结果发现：与对照相比，不同混栽组合处理中茄子根际土壤可培养微生物数量显著高于对照。这一结果与柴强等[23]，吴凤芝等[24]，张雪艳等[25]和赵索等[26]分别在玉米-蚕豆、玉米-鹰咀豆组合，以及黄瓜间套种、菜豆-芹菜-甜瓜轮作等处理条件下，发现间套种与轮作能有效地增加土壤细菌数量，减少病原菌数量，改善土壤微生物群落结构的研究结论相一致。上述结果证实间套作是一项能有效增加作物根际土壤微生物数量，改善作物根际微环境的有效措施。不同蔬菜混栽组合茄子根际土壤中β-葡糖苷酶、磷酸酶、氨肽酶活性均显著高于对照，尤其是茄子-菜豆和茄子-韭菜组合对提高茄子根际土壤酶活性的作用最为显著。微生物生物量越大，土壤保肥作用越强，并使土壤养分趋于积累。本文的试验结果发现：不同蔬菜混栽组合处理中茄子根际土壤微生物生物量碳、氮、磷均显著高于对照，尤其是茄子-菜豆和茄子-韭菜组合的提升效果最为显著。主要原因可能是茄子-菜豆和茄子-韭菜组合中茄子根际土壤可培养微生物数量的增加密切相关。如表2所示，茄子-菜豆和茄子-韭菜混栽组合中茄子根际土壤中可培养微生物，尤其是可培养细菌和放线菌数量显著高于其它3种蔬菜的混栽组合。

另一方面，基于高通量测序技术分析不同蔬菜混栽组合中茄子根际土壤的细菌多样性，发现不同蔬菜混栽组合茄子根际土壤细菌多样性指数、丰度和均匀度指数均高于对照。基于门分类水平还发现了Proteobacteria （变形菌门）、Acidobacteria （酸杆菌门）、Chloreflexi （绿弯菌门）、Gemmatimonadetes （芽单胞菌门）、Bacteroidetes （拟杆菌门）、Nitrospirae （硝化螺旋菌门）和Actinobacteria （放线细菌门）7大门类细菌。其中，变形菌门和酸杆菌门细菌是不同蔬菜混栽组合茄子根际土壤中的主要优势菌群。韩亚飞等[27]、王光华等[28]和戴雅婷等[29]人的研究亦发现变形菌门和酸杆菌门细菌是植被恢复或人工林土壤中的优势菌群。本文的分析结果与上述研究结果相类似。

因此，基于上述分析结果可知，5种蔬菜混栽组合均有效提高茄子根际土壤的肥力和细菌多样性，尤其茄子-菜豆和茄子-韭菜组合塑造了茄子根际土壤中可培养微生物数量更多、细菌多样性更为丰富的生态微环境。在未来生产实践中可作为一定的理论参考依据。

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