尖孢镰刀菌古巴专化型中SIX2和SIX6基因敲除突变体的生物学特性

杨腊英 陈平亚 郭立佳 梁昌聪 汪军 刘磊 周游 黄俊生

摘 要 尖孢鐮刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc）依据对寄主易感性分为4个不同的生理小种，其中4号生理小种（Foc4）几乎能危害目前所有栽培品种。为研究其SIX（secreted in xylem）蛋白编码基因SIX2和SIX6在Foc4对寄主差异性选择中的作用，利用PEG介导的原生质体转化法将基于pCT74质粒框架构建的SIX2、SIX6基因敲除质粒分别转入Foc4 B2菌株，分别得到了SIX2和SIX6基因敲除突变体，然后分析敲除突变体与野生型的生物学特性差异。生物学研究结果表明：SIX2、SIX6基因的缺失突变体均呈现菌丝稀疏、生长速率减慢、产孢率降低、菌丝异核率增加，对渗透压、外源氧等外源胁迫更为敏感等特征。致病力分析实验发现ΔFoSIX2和ΔFoSIX6突变体的孢子在香蕉苗的幼嫩根部附着量减少，孢子根部定殖能力降低；ΔFoSIX2菌株基本上丧失了对巴西蕉的致病力，而对粉蕉仍有较强的致病能力；ΔFoSIX6菌株则对粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力均呈极显著下降。依据生物学与致病力测定结果，推测Foc4中SIX6基因决定Foc4对寄主的致病力，而SIX2基因则决定Foc4对寄主的差异性选择能力。

关键词 香蕉枯萎病菌；基因敲除；生物学特性；SIX（secreted in xylem）蛋白编码基因；SIX2；SIX6

中图分类号 Q933 文献标识码 A

Abstract There are four recognized races of Fusarium oxysporum f. sp. cubense which are separated based on host susceptibility. Race 4 is capable of attacking ‘Cavendish （AAA） as well as the other varieties of banana affected by races 1 and 2. In order to study the roles of SIX2 and SIX6 genes encoding SIX （Secreted in xylem） protein in host xylem of Foc4 on host diversity selection， SIX2 and SIX6 gene knockout plasmids constructed from pCT74 plasmid framework were transferred into Foc4 B2 strain by PEG-mediated protoplast transformation respectively， SIX2 and SIX6 gene knockout mutants were obtained respectively， then the biological characteristics between knock-out strains and wild-type strains were analyzed. The results of biological studies showed that， compared with wild-type strain， SIX2 and SIX6 gene knock-out mutants had sparse hyphae， slow growth rate， less spores production， increased rate of mycelial heteronuclear， more sensitive to osmotic stress and other exogenous stress. Pathogenicity analysis found that compared with wild-type strain， the spores in both ΔFoSIX2 and ΔFoSIX6 knock-out mutants decreased the adhesion ability to the young roots of banana seedlings and had reduced colonization ability in the roots. ΔFoSIX2 knock-out mutants basically lost the pathogenicity to Musa acuminata AAA Cavendish cv. Bax， while still had a strong pathogenic ability to Musa sp ABB Pisang Awak. The pathogenicity of ΔFoSIX6 knock-out mutants were significantly decreased to M. acuminata AAA Cavendish cv. Bax and Musa sp ABB Pisang Awak. Based on the results of biology and pathogenicity， it was speculated that the SIX6 gene determined the pathogenicity of Foc4 to host， while SIX2 gene determined the ability of Foc4 to select wider hosts.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense； gene knock-out； biological characteristics； SIX （Secreted in xylem） protein encoding gene； SIX2； SIX6

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.021

由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc）引起的香蕉枯萎病是危害香蕉产业的重大病害之一。 Foc有4个生理小种，其中国内香蕉种植区发生危害的为1号生理小种（Foc race 1，Foc1）与4号生理小种（Foc race 4，Foc4）。Foc1危害基因型为AAB的Gros Michel及栽培种，Foc4不仅危害对Foc1与2号生理小种敏感的蕉类，还能危害现阶段商业化推广的Cavendish栽培种，其危害最大[1]。

尖孢镰刀菌在与寄主的相互作用中分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白（15.8～29.9 ku）进入木质部中启动致病力，被称为SIX（secreted in xylem）蛋白。目前，通过番茄木质部蛋白质组分析，比较清晰地明确了SIX蛋白在尖孢镰刀菌番茄专化型（F. oxysporum f. sp. lycopersici，Fol）入侵番茄中的作用，SIX1蛋白激发存在I-3抗性基因的番茄的效应蛋白触发免疫反应，SIX4蛋白为I-2-和I-3抗性基因介导的抗性抑制器，SIX3蛋白是致病因子并激发存在I-2抗性基因的番茄的效应蛋白触发免疫反应[2-5]，需要AVR2-SIX5基因对来激活番茄中的I-2介导的免疫[6]。目前通过反向遗传学等方法已鉴定了Fol中的SIX1～SIX14共14个SIX-基因[7-13]。前期研究主要是关于Fol 1号生理小种特有的SIX4 蛋白[4，13]，近期研究在Fol 2号和3号生理小种中发现被转座子Hormin插入截断的突变SIX4基因six4T [14-15]，发现甘蓝枯萎病病原菌（F. oxysporum f. sp. conglutinans）存在SIX4基因且為致病因子[16]，致病拟南芥的尖孢镰刀菌菌株Fo5176存在N-末端信号肽序列缺失的假SIX4b基因[17]。Niu等[18]发现西瓜病原菌（F. oxysporum f. sp. niveum）中的FonSIX6基因为无毒因子。

目前已在Foc中鉴定存在SIX1、SIX2、SIX6、SIX7、SIX8[19-20]，笔者通过与不同专化型菌株中的SIX基因序列比较与分析发现，用设计的引物序列扩增的Foc中SIX6基因序列可区分Foc与其他专化型[21]、SIX2基因序列为Foc4所特有[22]、SIX7基因序列是Foc4中的亚热带4号生理小种所有[23]。不同生理小种侵染的香蕉品种存在的差异性与Foc在寄主植物维管束组织中的成功定殖与否可能存在密切关系，而其中的SIX2和SIX6基因可能在其中发挥着关键性作用。目前国内外尚无对Foc中相关SIX基因功能研究的报道。本研究拟通过反向遗传学方法，利用同源重组、PEG介导的原生质体转化等手段，在香蕉枯萎病菌4号生理小种中分别敲除SIX2、SIX6基因，并分别对这2个基因敲除突变体的表型、生理生化性质及致病力等特征进行研究，从而探明SIX2、SIX6基因在病原菌中的功能，为香蕉枯萎病的防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株和质粒 供试Foc4野生型菌株Foc4-B2为本实验室2005年分离自海南乐东并鉴定保存。质粒pCT74（含有真菌启动子驱动的潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白GFP基因）由笔者所在单位张欣研究员赠送并由本实验室保存。

1.1.2 培养基 察氏培养基配方参见罗志兵等[24]的配方，YEPD培养基参见Yang等[25]的配方，PDB培养液按照方中达[26]的方法配置。

1.1.3 主要试剂和仪器 总RNA提取使用天根公司RNAprep pure Plant Kit试剂盒；反转录采用TaKaRa公司PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Erase试剂盒，DAPI染色液。Eppendorf微量移液器、Eppendorf Mastercycler PCR仪、UVITEC凝胶成像系统、Eppendorf 5417R离心机、Labconco冻干机、PolyScience恒温水浴锅、Leica倒置荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜（Olympus Fluo View FV1000）等。

1.1.4 引物 PCR引物（表1）合成及测序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 SIX2、SIX6基因的敲除及突变体鉴定 以Foc4-B2基因组DNA为模板，分别用设计有酶切位点的FoSIX2-A-F/FoSIX2-A-R与FoSIX2-B-F/FoSIX2-B-R、FoSIX6-A-F/FoSIX6-A-R与FoSIX6-B-F/FoSIX6-B-R引物对PCR扩增得到SIX2、SIX6基因上游与下游序列，将SIX2、SIX6基因上下游序列分别构建到基因敲除载体pCT74的潮霉素B与GFP基因两端，提取质粒后双酶切获得基因敲除片段A-Hyg+GFP-B，通过PEG介导的原生质体转化法将敲除片段转化到病原菌Foc4-B2中，获得带有潮霉素抗性的突变体。采用平板稀释的方法单孢分离转化子，将纯化后的转化子转接至含有潮霉素B浓度为100 μg/mL 的PDA固体培养基上，连续转接4次后得到稳定转化子并摇菌，按CTAB法提取DNA，分别用4对引物对SIX2、SIX6基因敲除突变体进行鉴定，其中引物对FoSIX2-F1/F2、F3/ FoSIX2-F4、Hyg-GFP-F/Hyg-GFP-R和FoSIX2-F/FoSIX2-R鉴定SIX2基因缺失突变体，其中引物对FoSIX6-F1/F2、F3/ FoSIX6-F4、Hyg-GFP-F/Hyg-GFP-R和FoSIX6-F/FoSIX6-R鉴定SIX6基因缺失突变体。

1.2.2 敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的表型观察 参照毛超等[27]的方法对敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6进行表型观察。

1.2.3 突变体异核体的观察 用灭菌后的牙签挑取新鲜野生型WT、ΔFoSIX2和ΔFoSIX6菌丝分别放入含有20 mL PDB 的100 mL三角瓶中，180 r/min，28 ℃摇床中培养2 d。将菌液吸出200 μL滴在载玻片上，向菌液中加入DAPI染色液10 μL，室温放置10 min后盖上盖玻片，荧光显微镜下观察异核体并统计异核率。异核率=异核体细胞数目/所统计的细胞总数×100%。

1.2.4 外源胁迫对敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6生长的影响 将Foc4-B2与突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的10 mm菌饼分别接种在各种添加外源胁迫条件的YEPD培养基上，28 ℃暗培养5 d后测量菌落直径并拍照记录。其中渗透压胁迫添加0、0.5、1.0 mol/L的NaCl、KCl，外源氧胁迫添加0、25、50 mmol/L的过氧化氢，锂离子胁迫添加0、0.5、1 mol/L的醋酸锂，细胞壁选择性压力添加0、0.5、1.0 mol/L的甘油和山梨醇，其中H2O2对菌落生长的抑制率采用以下公式计算：抑制率=（D1- D2）/ D1×100%，其中：D1为在不含H2O2的平板上生长的菌落直径；D2为同一菌株在含不同浓度H2O2平板上生长的菌落直径。

1.2.5 粗毒素对假茎致病力测定及对巴西蕉苗根的影响 分别将野生型与突变体菌株的5个直径为10 mm菌饼接种于150 mL PDB 培养基中，180 r/min，28 ℃摇床中培养15 d，过滤除菌得到粗毒素，将新鲜的巴西蕉假茎放入试管中，接種2 mL粗毒素。以清水为空白对照，每个处理重复3次，28 ℃密封3 d后观察并拍照记录。将野生型与突变体菌株的菌饼分别接种于察氏液体培养基，28 ℃培养15 d，获得的培养液用3层灭菌滤纸过滤后收集滤液，即为所需的粗毒素提取液。选取长势相同的巴西蕉苗（M. acuminata AAA Cavendish cv. Bax），将苗的根部用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗3遍，在75%酒精中消毒 1 min。将根部分别浸泡在野生型和突变体菌株的粗毒素提取液中。以灭菌后的空白察氏液体培养基为对照CK，3 d后观察并拍照记录。

1.2.6 敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6对香蕉苗水培致病性试验及根部入侵情况观察 分别将野生型和突变体菌株接到改良察氏培养基上，28 ℃条件下培养3 d。将直径为10 mm菌饼接种于200 mL PDB培养基中，180 r/min，28 ℃摇床中培养5 d。用3层擦镜纸过滤，收集滤液。4 000 r/min离心后收集沉淀，并用无菌水重悬沉淀，显微镜下用血球计数板调整孢子浓度为106 cfu/mL。将长势大小基本一致的组培袋装香蕉苗分别侵泡于孢子悬浮液中，对照组侵泡于清水中，以绿色荧光蛋白标记的野生型菌株WT为对照，分别于第3天、第6 天、第9天取香蕉苗根部于共聚焦显微镜下观察侵染情况，拍照记录。

1.2.7 敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6对巴西蕉、粉蕉致病能力测定 将直径为10 mm菌饼接种于200 mL PDB培养基中，180 r/min，28 ℃摇床中培养5 d。用3层擦镜纸过滤，收集滤液。4 000 r/min离心收集沉淀，并用无菌水重悬沉淀，显微镜下用血球计数板调整孢子浓度为106 cfu/mL。采集土壤灭菌后备用，将长至6片叶左右的巴西蕉（M. acuminata AAA Cavendish cv. Bax）和粉蕉（M. sp ABB Pisang Awak）椰康杯苗分别移栽至花盆中并浇水，干旱处理7 d。将100 mL孢子悬浮液均匀浇在根部周围土壤中，适当浇水，不同突变体菌株每个处理15株，30 d后观察到巴西蕉的叶片开始出现变黄等症状时，随机取病株进行切根观察，当野生型的对照病情指数达到4级左右便全部切根观察，统计发病结果。

1.3 数据统计与分析

病情指数的统计方法如下：1级：球茎不变色；2级：球茎不变色，但根与球茎交接触处变色；3级：0～5%球茎变色；4级：6%～20%球茎变色；5级：21%～50%球茎变色；6级： 50%以上球茎变色；7级：全部球茎变色；8级：死株。病情指数=Σ（发病级数×该级株数）/（最高级数×总株数）×100。

利用SAS9.0数据处理系统和Microsoft Excel XP进行数据统计和作图，方差分析采用Duncan新复极差法，数值采用对数置换后进行分析。

2 结果与分析

2.1 SIX2、SIX6基因缺失突变体鉴定

为了研究Foc-B2菌株中SIX2、SIX6基因在香蕉枯萎病菌对寄主差异性选择中的功能，通过构建分别得到了基因敲除载体pCT74-FoSIX2、pCT74-FoSIX6，并通过双酶切等手段分别获得了SIX2、SIX6基因敲除片段A-Hyg+GFP-B，将该片段转化Foc4-B2菌株分别得到了21、19个具有潮霉素抗性的突变体，连续转接3代后，随机取8个突变体提取基因组DNA，使用4对引物FoSIX2-F1/F2、F3/ FoSIX2-F4、Hyg-GFP-F/Hyg-GFP-R和FoSIX2-F/FoSIX2-R对SIX2基因缺失突变体进行PCR验证， FoSIX6-F1/F2、F3/ FoSIX6-F4、Hyg-GFP-F/Hyg-GFP-R和FoSIX6-F/FoSIX6-R对SIX6基因缺失突变体进行PCR验证，结果表明8个突变体中FoSIX2基因有7个为缺失突变体（图1），FoSIX6基因有6个为缺失突变体（图2），同源重组的效率较高。

2.2 敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的表型观察

通过对敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的菌丝进行显微观察后发现敲除突变体的菌丝与野生型相比略微稀疏（图3-D～F），而两者分生孢子的形态没有差别（图3-A～C）。在固体YEPD平板上野生型菌株比敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的生长速度略快，菌丝更为致密；敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的菌丝向外呈辐射状（图 4-A～C）。在液体YEPD培养基中，野生型Foc4-B2菌株能形成完整的菌膜，而敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6形成的菌膜疏松，并且有菌丝团形成（图4-D～F）。

2.3 突变体异核体的观察

在荧光显微镜下可以观察到突变体的菌丝存在大量的异核现象（图5-B～C），而野生型的菌丝很少存在异核现象（图5-A），突变体的孢子存在异核现象而野生型的孢子未能观察到异核现象（图5-D～F）。通过对100个菌丝中分隔清晰的细胞进行统计，突变体菌株ΔFoSIX2的菌丝异核率为66%，突变体菌株ΔFoSIX6的菌丝异核率为87.5%，野生型的异核率为17.4%。

2.4 外源胁迫下敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的生长模型

把不同浓度的氯化钠和氯化钾加入到YPD培养基中后加入培养野生型和突变体，结果发现突变体ΔFoSIX2和ΔFoSIX6对于外源环境的渗透法胁迫更敏感度，在1.0 mol/L NaCl和更高浓度的渗透压胁迫下无法生长，而野生型在1.5 mol/L NaCl的渗透压仍能缓慢生长。在同等KCl 渗透压浓度下，野生型抑制率为50%，而突变体ΔFoSIX2和ΔFoSIX6的抑制率分别达62.5%、83.3% （图6）。

在25、50 mmol/L H2O2的YEPD培养基的平板上，ΔFoSIX2突变体的生长抑制率分别为28.6%和43.4%，ΔFoSIX6突变体的生长抑制率分别为31.5%和55.1%，野生型B2菌株的生长抑制率分别为4.5%和15.8%。在外源氧化胁迫環境下，ΔFoSIX2和ΔFoSIX6的菌丝生长受到的抑制明显比野生型菌株受到的抑制更严重，当H2O2浓度达到50 mmol/L时候，突变体菌株ΔFoSIX6抑制最严重（图7）。通过观察在含有不同浓度醋酸锂的YEPD平板上突变体的生长情况后发现，各个突变体与野生型相比在锂离子胁迫情况下的生长没有明显的差别（图7）。

通过观察不同浓度细胞壁选择性压力条件下敲除突变体的生长情况，结果发现，与野生型相比突变体ΔFoSIX2和ΔFoSIX6菌丝密度略微下降，生长速率较为缓慢，但相互间抑制率差异性不明显（图8）。

2.5 粗毒素对巴西蕉假茎及根的影响

野生型粗毒素处理的假茎末端有严重的褐变现象，而突变体ΔFoSIX2和ΔFoSIX6粗毒素处理的假茎只有略微的褐变现象，CK清水对照处理的香蕉假茎几乎没有褐变现象发生（图9-A）。对香蕉苗根部处理的试验结果表明，5 d后野生型粗毒素处理的香蕉苗全部叶片发黄，萎蔫严重，根部褐化腐烂；突变体ΔFoSIX2处理的香蕉苗边缘的叶片正常，根部部分褐化；突变体ΔFoSIX6粗毒素处理的香蕉苗根部几乎没有褐化，叶片略微有一点发黄。对照组处理的香蕉苗叶片健康程度良好，幼嫩的的香蕉苗根部成白色，与处理之前基本相同（图9-B）。

2.6 敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6对香蕉苗水培致病性试验及根部入侵情况观察

根据试验结果（图10），7 d后野生型菌株处理过的叶片出现明显的萎蔫现象，香蕉苗根部已经褐化并且腐烂。突变体ΔFoSIX2和ΔFoSIX6菌株处理过的香蕉苗的叶片几乎没有黄化枯萎现象，根部轻微褐化，并且长出白色须根。对照组香蕉苗的根部生长正常，长出白色须根，叶片没有出现萎蔫现象。突变体ΔFoSIX2和ΔFoSIX6的回复突变又使其致病能力恢复到野生型。

将野生型和突变体孢子悬浮液处理3 d后的香蕉苗根部放置于共聚焦显微镜下观察，发现GFP标记的野生型菌株和突变体ΔFoSIX2都有部分孢子附着在根部表面。ΔFoSIX6菌株处理香蕉苗根部没有孢子附着。处理第6天时候，可以观察到野生型有菌丝侵入香蕉苗的根部，并且野生型菌处理组附着的孢子比突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6菌株附着的孢子多，ΔFoSIX2、ΔFoSIX6处理组香蕉苗根部没有菌丝侵入。处理第9天，野生型处理的香蕉苗根部组织内可以观察到大量菌丝入侵，突变体处理的香蕉苗根部附着的孢子较少且没有菌丝侵入。说明ΔFoSIX2、ΔFoSIX6突变体在木质部中定殖和分泌蛋白的能力减弱（图11）。

2.7 敲除突变体ΔFoSIX2、ΔFoSIX6对巴西蕉、粉蕉致病能力测定

相同菌株对粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力测定结果表明（表2）：B2-GFP菌株的病情指数分别为89.4、50.0，ΔFoSIX2的病情指数为分别为47.9、16.7，ΔFoSIX6的病情指数分别为15.0、25.0，而空白对照的病情指数为12.5、16.7，突变体ΔFoSIX2和ΔFoSIX6处理的粉蕉、巴西蕉发病情况极显著性低于野生型 （表2）。同时由表2可看出，突变体ΔFoSIX2菌株基本上丧失了对巴西蕉的致病力，而对粉蕉仍有较强的致病能力；突变体ΔFoSIX6菌株则对粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力均呈极显著下降。

3 讨论

香蕉枯萎病（Fusarium wilt of banana）在世界主要香蕉产区先后发生并造成了极为严重的危害，是目前困扰世界香蕉产业发展的一大难题。依据目前国内外防控香蕉枯萎病的研究进展，使用抗病品种是控制香蕉枯萎病最根本的出路[28]，而对相关致病基因的认识可能有助于发展抗香蕉枯萎的香蕉品种[29]。

SIX蛋白编码基因在Fol中的功能研究较为清晰，其他尖孢镰刀菌专化型中的SIX蛋白质可能参与了决定菌株的毒力/无毒性或宿主特异性[16]，如其中的SIX4基因在Fol中为无毒因子，但在甘蓝枯萎病病原菌F. oxysporum f. sp. conglutinans中则为致病因子[16]；西瓜病原菌F. oxysporum f. sp. niveum中的FonSIX6基因为无毒因子[18]。Kashiwa等[30]利用等强度均一电场凝胶电泳（contour-clamped Homogeneous Electric Field，CHEF）对Fol 4287菌株及F. oxysporum f. sp. conglutinans菌株的分析，发现每个小染色体上的SIX基因的特殊组合各不相同；此外，SIX基因位置取决于分离株，并非所有的SIX基因都在小染色体上发现，有些是在大染色体上。

本研究利用同源重組的手段在Foc4-B2中敲除了SIX2和SIX6基因，通过对敲除突变体与野生型的生物学特性比较后发现，SIX2、SIX6基因的缺失突变体均有菌丝稀疏、生长速率减慢、产孢率降低、菌丝异核率增加、对温度、pH及渗透压等外源胁迫更为敏感等特征。通过致病力实验发现，ΔFoSIX2和ΔFoSIX6突变体的孢子在香蕉苗的幼嫩根部附着量减少，孢子入侵数目降低，ΔFoSIX2菌株基本上丧失了对巴西蕉的致病力，而对粉蕉仍有较强的致病能力；ΔFoSIX6菌株则对粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力均呈极显著下降。依据研究结果推测Foc4中SIX6基因为Foc4菌株的致病因子，而SIX2基因则决定Foc4对寄主的差异性选择能力。

本研究虽然得到了一系列敲除突变体与野生型相比生物学特性上的变化，尤其是对不同香蕉品种致病能力差异的变化，但引起这些变化的分子机制还不清楚。下一步研究的重点将是开展蛋白组学与代谢组学相关研究，进一步明确SIX2与SIX6基因在Foc中的确切作用，为下一步Foc的田间防控尤其是抗病品种的培育提供作用靶标。

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