墨兰（Cymbiduim sinense）组培快繁技术体系研究

2018-05-14许申平袁秀云王默霏崔波

热带作物学报 2018年5期

许申平　袁秀云　王默霏　崔波

摘要墨兰种子无胚乳的结构特征使其自然萌发率极低，从而导致墨兰种苗的繁殖速度不能满足市场需求。本研究以成熟墨兰种子诱导出的生长良好、性状统一的根状茎为材料，研究墨兰根状茎的增殖、绿芽分化及生根壮苗的情况。结果表明：MS培养基为最适合墨兰根状茎增殖的基本培养基，在该培养基中加入6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L与吲哚丁酸（IBA）0.1 mg/L时，根状茎增殖的效果最好，增值系数达到10.33；在根状茎分化阶段，培养基中最佳的激素配比为6-BA 5.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.5 mg/L，分化系数达到6.43；生根壮苗阶段，在不添加激素的生根培养基中，生根率达到100%。本研究建立了墨兰组培快繁技术体系，可实现短时间内大量的种苗繁殖。

关键词墨兰；组织培养；根状茎；分化

中图分类号 S682.3 文献标识码 A

Abstract The propagation of C. sinense is greatly restricted by the low seed germination rate due to immature embryo and no endosperm under natural conditions. In this study， the rhizomes of well grown and uniformity induced by seeds in C. sinense were used as the materials. The influence of different plant growth regulators on culture in vitro of C. sinense was studied. The results showed that the optimum basic medium for the multiplication and growth of the rhizomes was MS medium， and the best hormone combinations of multiplication was 6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L， with a multiplication rate of rhizomes up to 10.33. The optimum plant growth regulator combination for differentiation of rhizomes was 6-BA 5.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L， with a regeneration rate 6.43. All buds produced roots on basic medium with no plant hormone on MS medium. The present study established an efficient propagation system during industrial seedling production and provided a good theoretical and technological support for improving seedlings quality of C. sinense and its industrial production in a large scale.

Key words Cymbidium sinensis； tissue culture； rhizome； differentiation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.015

墨兰（Cymbiduim sinense）为兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）多年生草本花卉，主要分布于中国台湾、福建、云南、广西和广东等地区。因其叶形独特，花色素雅，花香馥郁，素有“花中四君子”之一的美称；深受人们的喜爱，具有很高的经济价值和观赏价值。墨兰和多数兰科植物一样，种子无胚乳，自然萌发率极低。传统的墨兰繁育多采用分株繁殖，但分株繁殖率不高，繁殖的时间较长，繁殖得到的植株还容易引起病毒，不能实现墨兰大批量生产以满足市场的需求。墨兰种苗的繁殖速度慢是影响墨兰产业兴起的重要因素之一。

随着组织培养技术的发展，该技术已成为墨兰进行大量繁殖的重要手段[2-3]。早在80年代，Hasegawa等[4]就报道了分别用种子和茎尖进行墨兰的组织培养。随后，国内外开展了一系列墨兰组织培养的研究。外植体的选择主要涉及根状茎[5]、种子[6-7]、茎尖[7]、幼叶[8]和花芽[7]等。后续的研究多以根状茎为外植体。在墨兰组织培养的研究中，常见的培养基有1/2 MS、MS、花宝1号、花宝2号、ZW和KC[9]，但对于最优基本培养基目前并没有统一的标准。郑艳艳等[10]认为，在根状茎的增殖试验中，花宝1号和花宝2号混合使用时明显好于MS培养基；而丁雪珍等[11]认为最适于墨兰根状茎增殖的基本培养基为1/2 MS。关于激素的使用，目前涉及较多的有6-BA、NAA、KT、IBA、TDZ等，但关于激素的最适剂量并不统一，如在墨兰根状茎增殖研究中，施福军等[9]认为2.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L

NAA较适宜墨兰根状茎增殖培养；郑艳艳等[12]认为添加2.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA时根状茎的增殖效果最佳；丁雪珍等[11]认为2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L

NAA组合对墨兰的增殖效果最好；墨兰的增殖系数基本在8左右。在墨兰根状茎分化绿芽的研究中，有研究认为6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的MS培养基中，诱导芽分化的效果最佳[13]；傅雪琳等[14]認为绿芽分化最佳的激素配比为5.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA；陈兰芬等[15]认为墨兰根状茎分化的最适培养基为MS+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA。在墨兰生根壮苗的研究中，鲁雪华等[13]认为在附加0.2 mg/L NAA的MS培养基中，幼苗的生根效果最佳；项艳等[16]认为生根的最佳培养基为：1/2 MS+NAA 3.0 mg/L；黄显进等[16]则认为MS+NAA 5.0 mg/L生根效果最好。

综上所述，虽然墨兰的组织培养和快速繁殖已经取得了较大的进展，但研究结果并不统一，大部分研究仅涉及墨兰组织培养的其中一个阶段，如根状茎的增殖、根状茎分化成苗究、试管苗快速生根试验研究等；即使是关于墨兰组织培养技术体系的研究，仍然存在一些问题，如在培养过程中繁殖系数偏低、生长缓慢、继代周期长等[18]。为了提高墨兰繁育的效率，本研究在前期研究的基础上，通过对墨兰根状茎增殖、绿芽分化及生根壮苗进行系统研究，以期建立一套适合墨兰种苗工厂化生产的组织培养技术体系，为墨兰大规模快繁生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

在无菌条件下，将成熟的墨兰种子播种于1/2 MS+椰汁20%+琼脂7.5 g/L+蔗糖20 g/L+活性炭1 g/L培养基上，诱导萌发根状茎。60 d后，以诱导的生长良好、性状统一的根状茎为试验材料。椰汁为原产海南的新鲜椰子直接提取；琼脂购于福建省石狮市闽南琼胶有限公司；墨兰种子由郑州师范学院生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 根状茎增殖基本培养基的筛选为了研究不同培养基对根状茎增殖的影响，分别以MS、1/2 MS和花宝一号培养基为基本培养基，添加25 g/L蔗糖、7.5 g/L琼脂和2 g/L活性炭进行试验，以筛选出最适根状茎增殖的基本培养基。将生长良好、性状统一的根状茎切取1 cm左右，接入MS、1/2 MS和花宝一号这3种基本培养基中。每瓶接种5根，6瓶为 1 个重复，设3 个重复，60 d后观察其生长情况，并算出每种培养基的增殖系数。

1.2.2 激素配比对根状茎增殖培养的影响以MS+25 g/L糖+7.5 g/L琼脂+2 g/L活性炭为基本培养基，将种子诱导的根状茎接种在附加6-BA和IBA的不同浓度配比的培养基上，6-BA的浓度分别是1.0、3.0、5.0 mg/L，IBA的浓度分别是0.1、0.3、0.5 mg/L，进行双因素正交试验，观察根状茎的增殖情况，以筛选最佳培养基。每瓶接种5根，每根

1 cm左右，6瓶为 1个重复，设3个重复，每种浓度共接种30根根状茎，2个月后统计分化根状茎数，并计算增殖系数。

1.2.3 根状茎的绿芽分化为探究不同激素配比对墨兰根状茎绿芽分化的影响，以MS+25 g/L糖+7.5 g/L

琼脂为基本培养基，将诱导出的根状茎接种到附加6-BA和NAA不同浓度配比的培养基上，6-BA的浓度分别是1.0、3.0、5.0 、7.0 mg/L，NAA的浓度分别是0.1、0.3、0.5 、0.7 mg/L，进行双因素正交试验。每瓶接种根状茎5个，长度1 cm左右，每个浓度6瓶，设3个重复。60 d后根据根状茎芽的分化情况统计出芽总数，观察绿苗的长势，并计算平均每个根状茎的分化系数。

1.2.4 生根壮苗为探究墨兰根状茎分化绿芽的最适培养基，将根状茎诱导出的绿芽接种到附加不同激素配比的培养基上，以MS+25 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂+2 g/L活性炭为基本培养基，其中6-BA的浓度分别是0、0.1、0.3 mg/L，NAA的浓度分别是0、0.3、0.5 mg/L，进行双因素正交试验。每瓶接种5个根状茎分化的绿芽，每个浓度接种6瓶，设3个重复。

60 d后观察绿芽的生长和生根情况，统计生根总数，并计算出每个芽生根数及生根率。

1.2.5 培养条件试验中组织培养室的培养温度为（25±2）℃，光照强度为1 500～2 500 lx，每天12～14 h。所有培养基的pH值介于5.8～6.2之间。

1.3 统计分析

数据的统计分析以Excel 2010和SPSS 22.0软件进行，平均数据以平均数±标准误（S.E.）表示，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法（Duncans multiple ranger test）。统计数据指标包括：根状茎增值系数=新增根状茎数/接种根状茎数；根状茎分化系数=分化芽总数/接种根状茎数；绿芽生根数=生根总数/接种芽数，绿芽生根率=（生根芽数/接种芽数）×100%。

2 结果与分析

2.1 根状茎增殖基本培养基的筛选

由表1可知，由于未添加激素，墨兰根状茎在MS、1/2 MS和花宝1号3种培养基中的增殖系数均比较低。其中，MS培养基中的根状茎粗壮，且每个根状茎的分枝最多，增殖系数为3.50；花宝1号培养基中的根状茎生长状态较好，每个根状茎增殖的数量较多，增殖系数为3.16，但不及MS培养基中的根状茎数；接入1/2 MS培养基中的根状茎生长情况最差，增殖系数仅为2.02，最不适合根状茎的生长。可见根状茎最适合在MS中生長，因此，在后续的研究中均以MS为基本培养基。

2.2 不同浓度配比的6-BA与IBA对根状茎增殖培养的影响

经过2个月培养后，根状茎分化培养的结果统计如表2所示。试验1组6-BA 1 mg/L+IBA 0.1 mg/L的激素配比对根状茎的增殖效果最显著，根状茎嫩绿、粗壮、生长较迅速且增殖的根状茎数量较多，增殖系数可达12.33（图1-A）；试验2组6-BA 1 mg/L+IBA 0.1 mg/L的激素配比对根状茎的增殖效果也较好，虽然增殖系数低于第1组，但增殖系数可达10.53；其它激素组合的根状茎生长速度比较缓慢，长势不好，比较细弱，且增殖数量较少。本试验结果显示，当6-BA的浓度增加时，根状茎的增殖效果不好，而低浓度时根状茎的分化率较高，可能是高浓度的6-BA对根状茎的增殖有一定的抑制作用。

2.3 不同培养基对根状茎芽分化的影响

由表3可知，将根状茎接入分化芽培养基培养2个月后，试验11组的出芽总数最高，30个根状茎共分化出193个绿芽，分化系数达到6.43；试验10组和12组对根状茎的分化也有显著的促进作用，分化系数分别达5.33和5.20；当6-BA的浓度高于或低于5 mg/L时，根状茎的分化系数均出现下降的趋势，这说明6-BA对促进墨兰根状茎芽的分化具有一定的浓度范围，高于或低于这个范围均不利于根状茎芽的分化。因此，在基本培养基中添加6-BA 5 mg/L与NAA 0.5 mg/L时，根状茎的绿芽分化效果最好，且分化的芽饱满色绿（图1-B）。

2.4 生根壮苗

将墨兰根状茎分化的绿芽接种到不同激素配比的培养基中，2个月后各处理的绿芽生根情况如表4所示。在不添加任何激素的MS+25 g/L糖+7.5 g/L琼脂+2 g/L活性炭的基本培养基中，墨兰的生根效果最好，每个绿芽平均生根8条，生根率达到100%，而且绿芽生长健壮（图1-C）。随着NAA浓度的增加，绿芽生根率降低，每个芽的平均根数也有所降低，当NAA的含量增加到0.5时，生根率为85%。但6-BA的附加显著降低了绿芽的生根率，这说明在墨兰绿芽生根壮苗的过程中随着植物激素的增加幼苗生根率逐渐降低，因此，在墨兰生根壮苗的培养基中不适宜添加6-BA和NAA。

3 讨论

墨兰的组织培养是其进行大量繁殖的重要手段，一般包括根状茎的诱导、增殖、分化和生根壮苗四大步骤[19]。墨兰的根状茎诱导率高，既能方便保存又能快速地分化出芽和根，在墨兰快繁体系中非常重要。目前，在大部分的墨兰快繁研究中，均以根状茎为试验材料[9-10， 14]，本研究也以种子诱导的根状茎为外植体，开展一系列的研究。不同基本培养基对墨兰根状茎增殖分化效果不同，以MS较适宜，这与以往的研究认为墨兰需要无机盐较高的培养基一致[20-21]。影响根状茎增殖速度和芽分化率的因素较多，其中较为重要的有基本培养基类型、植物生长调节剂的种类及其使用浓度和培养条件。

大多数植物激素在调控植物生长发育过程中的作用比较复杂，同一种激素可调控多个发育过程，而同一个特定的发育过程需要多种不同激素的协同作用[22]。6-BA能诱导不定芽的产生，促进侧芽生长和细胞分裂；IBA能促进细胞分裂与细胞再生，诱导形成不定根[2]。在本研究中，以6-BA 1 mg/L+IBA 0.1 mg/L激素配比诱导的根状茎伸长生长速度远大于增粗生长，且产生多个细小分枝，在提高墨兰根状茎分化率的同时有利于延缓高代繁殖根状茎的老化，同时该激素配比使墨兰根状茎的增殖系数可达12.33，远超过前人研究所得（8.3[11]、7.4[9]和5.9[23]等）。与前人的研究不同，本研究将IBA应用于墨兰根状茎的增殖，并取得了较好的增殖效果。在线艺春兰的研究中发现0～3.0 mg/L范围内，IBA促进根状茎的生长较NAA效果好[23]，但对这一影响机理还有待于进一步研究。

在墨兰根状茎绿芽分化的研究中，较低的分化率增加了墨兰组织培养的难度，大量研究结果表明，墨兰根状茎绿芽分化阶段需要较高的细胞分裂素浓度和较低的生长素浓度，且二者比例合适，才能由脱分化阶段转入分化阶段，进行绿芽再生[18]。本研究利用6-BA 5 mg/L与NAA 0.5 mg/L的激素配比，使墨兰根状茎绿芽分化系数达到6.43。这一结果进一步证实了高浓度的6-BA和低浓度的生长素有利于不定芽分化的结论。虽然这一激素配比与傅雪琳等[14]的研究一致，但其分化率仅为180%，导致这一结果的主要原因可能是墨兰根状茎增殖阶段应用的外源激素不同，使得根状茎内源激素积累的不平衡，影响了绿芽的分化阶段。在墨兰生根壮苗的研究中，以添加NAA的报道居多，但添加剂量各不相同，从0.2～5 mg/L[13， 16-17]都有报道，在本研究中，以基本培养基不添加任何激素最佳，生根率达到100%，这可能与兰花叶根同生的特性相关。

总之，关于墨兰的许多研究结果接近但又不一致，其一可能与墨兰不同品种、不同外植体部位对培养基组分和培养条件的要求不同；其二可能与墨兰组织培养的阶段性有关，目前大部分的研究，仅选择根状茎的诱导、增殖、分化和生根壮苗的其中一个阶段进行研究，但不同阶段激素的用量会通过在植物体内的积累影响下一阶段的结果，而对于墨兰系统性研究的报道并不多见。因此，本研究通过对墨兰组织培养系统的研究，结果发现MS培养基为最适墨兰根状茎增殖的基本培养基，在该培养基中加入6-BA 1.0 mg/L与IBA 0.1 mg/L时根状茎增殖的效果最好；在根状茎分化阶段，培养基中最佳的激素配比为6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；生根壮苗阶段，在不添加激素的基本培养基中发现生根率可达100%。

参考文献

[1] 刘仲健，陈心启，茹正忠. 中国兰属植物[M]. 北京：科学出版社，2006：360.

[2] 张小娟，陈秀萍，李云霞，等. 墨兰种子无菌萌发及根状茎诱导分化研究[J]. 中国园艺文摘，2017，33（10）：12-16.

[3] 左利娟，湯久杨，李志强. 墨兰杂交及F1代离体培养研究[J]. 北京农业职业学院学报，2017，31（3）：22-25.

[4] Hasegawa A，Ohashi H，Goi M. Effects of BA，rhizome length，mechanical treatment and liquid sharking culture on the shoot formation from rhizome in Cymbidium faberi Rolfe[J]. Acta Hortic，1985（166）：25-40.

[5] 翁锦周，林加耕，林江波. 不同浓度活性炭对墨兰离体培养的影响[J]. 亚热带植物科学，2006，35（3）：37-38.

[6] 彭晓明，曾宋君，张京丽，等. 三种墨兰的瓶播培养（简报）[J]. 热带亚热带植物学报，2000，8（1）：60-62.

[7] 张志胜，欧秀娟. 墨兰的组织培养[J]. 园艺学报，1995，23（3）：303-304.

[8] 曾宋君，程式君，张京丽，等. 墨兰及其杂种的组织培养与快速繁殖[J]. 广西植物，1998（2）：58-61.

[9] 施福军，莫昭展，韦江萍，等. 墨兰的无菌播种及根状茎的增殖研究[J]. 安徽农业科学，2008，36（32）：13 968-13 969.

[10] 郑艳艳，朴炫春，李嬿，等. 几种因素对墨兰根状茎增殖生长的影响[J]. 延边大学农学学报，2010，32（4）：254-256.

[11] 丁雪珍，韩磊，张文静. 墨兰增殖培养基的筛选研究[J]. 北方園艺，2009（8）：208-209.

[12] 郑艳艳. 墨兰组培体系的优化及根状茎在生物反应器培养的研究[D]. 延吉：延边大学，2011.

[13] 鲁雪华，郭文杰，林勇. 墨兰的无菌播种和植株再生[J]. 亚热带植物科学，1999，28（1）：34-37.

[14] 傅雪琳，张志胜，何平，等. 墨兰根状茎绿芽分化的研究[J]. 华南农业大学学报，2000，21（3）：53-55.

[15] 陈兰芬，王晶，田亦平，等. 墨兰组织培养根状茎分化技术研究[J]. 河北林果研究，2011，26（1）：22-24.

[16] 项艳，於凤安，彭镇华. 墨兰离体快繁研究[J]. 林业科学研究，2003，16（4）：434-438.