巴西橡胶树ADF6基因的克隆与表达分析

邓治 金志强 刘辉 杨洪 代龙军 李德军

摘 要 肌动蛋白解聚因子（Actin Depolymerizing Factor，ADF）是一种重要的肌动蛋白结合蛋白。ADF通过参与调控肌动蛋白的装配和解聚在多种生理过程中发挥重要作用。本研究通过RT-PCR技术从橡胶树胶乳中获得HbADF6基因的cDNA和基因组序列，序列分析显示HbADF6基因的开放阅读框为441 bp，共编码146个氨基酸，基因组序列由2个内含子和3个外显子组成。实时荧光定量PCR结果表明，HbADF6基因在所有检测组织中均表达，其中树皮中表达量最高，叶片中表达量最低。HbADF6基因的表达受乙烯利（ET）和碘化钾（KI）调控，并与排胶时间和死皮有关。此结果表明HbADF6基因可能在橡胶树乙烯响应、死皮和排胶过程中发挥重要作用。

关键词 肌动蛋白解聚因子；巴西橡胶树；排胶；表达分析

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Actin depolymerizing factor （ADF） is an important class of actin binding proteins. ADF is involved in regulating actin assembly and disassembly and plays an important role in several physiology process. In this study， the cDNA and genomic sequence of HbADF6 were isolated from H. brasiliensis by RT-PCR. Sequence analysis showed that the open reading frame sequence of HbADF6 was 441 bp in length， which encoding 149 amino acids. The genomic sequence contained two introns and three exons. Quantitative real-time PCR results showed that HbADF6 expressed in all test tissues， with the highest expression in barks and lowest expression in leaves. HbADF6 expression was regulated by ethylene （ET） and potassium iodide （KI）. In addition， HbADF6 expression associated with latex flow time and tapping panel dryness （TPD）. The results suggest that HbADF6 may play important roles in ethylene resposnse， TPD and latex flow in Hevea brasiliensis.

Key words actin depolymerizing factor； Hevea brasiliensis； latex flow； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.011

作為细胞骨架中微丝的主要组成成分，肌动蛋白广泛存在于所有真核细胞中。它参与很多重要的细胞过程，如囊泡运输、细胞器运动和重排、胞质运动和顶端生长等[1]。大量的肌动蛋白结合蛋白直接调控肌动蛋白动态结构，使其呈高度有序的状态。肌动蛋白解聚因子（Actin Depolymerizing Factor，ADF）是真核生物中重要的肌动蛋白结合蛋白，由多基因家族成员组成，蛋白分子量在13～19 ku之间[2]。典型的ADF家族成员能结合球形肌动蛋白（G-肌动蛋白）和纤丝型肌动蛋白（F-肌动蛋白），切割F-肌动蛋白为小片段，从而提供新的肌动蛋白丝起始位点，增加肌动蛋白单体在肌动蛋白丝末端的解离速度，为F-肌动蛋白正端聚合提供更多单体，从而提高肌动蛋白聚合及解聚的动态变化[3]。1993年Kim等[4]从百合中分离到植物ADF基因，随后在苔藓、水稻、拟南芥、小麦、巴西橡胶树等植物中都鉴定到ADF基因。ADF基因在植物生长和发育过程中发挥着重要作用。拟南芥中过表达GhADF7基因引起花粉粒存活率下降，减慢花粉管的生长，转基因植株部分雄性不育[5]。GhADF1基因下调表达改变细胞壁的形态和延长纤维细胞的长度[6]。黑暗条件下拟南芥adf4突变体幼苗胚轴和根均长于野生型[7]。此外，ADF基因还与胁迫响应有关。小麦TaADF4基因通过调节肌动蛋白细胞骨架正调控小麦植物免疫反应[8]。异源过表达OsADF3基因能提高拟南芥对甘露醇和干旱胁迫的抗性[9]。adf4突变后显著提高拟南芥对白粉病的抗性，敲减第I亚类的ADFs（ADF1-4Ri）后该抗性得到进一步增强[10]。

巴西橡胶树（简称橡胶树）是一种重要的热带经济林木。割胶产生的胶乳作为橡胶树的次生代谢产物，是天然橡胶最主要的来源。橡胶树排胶时间是影响胶乳产量的关键因素之一，乳管伤口堵塞物的形成决定着排胶时间。已有研究结果发现，随着排胶的进程，橡胶树乳管伤口末端逐渐形成“蛋白质网”结构[11-12]。胶乳中肌动蛋白含量逐渐减少，乳管伤口末端“蛋白质网”的形成与肌动蛋白聚集同时发生[13-14]。推测肌动蛋白微丝骨架在“蛋白质网”的形成过程中可能发挥着重要作用，从而影响橡胶树乳管伤口堵塞物的形成[15]。根据上述结果笔者推测橡胶树ADF可能通过调节肌动蛋白动态变化在乳管堵塞过程中发挥作用。此前，本项目组克隆了橡胶树胶乳ADF家族基因中的1个成员HbADF[16]，研究发现HbADF表达与橡胶树排胶和死皮相关[17]。本研究克隆橡胶树胶乳中另一个ADF家族成员HbADF6基因的cDNA和基因组序列，对其表达模式和系统进化关系进行分析。为进一步研究HbADF6基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）均种植于中国热带农业科学院试验农场。选取10 a割龄的橡胶树品系PR107为实验树，采集不同死皮（Tapping Panel Dryness， TPD）等级橡胶树胶乳样品。采集开割橡胶树品系热研7-33-97的胶乳、叶片、树皮、雌花和雄花作为组织样品。选取未开割的橡胶树品系热研7-33-97幼树，分别用1%乙烯利（ET）和3%碘化钾（KI）对割面上下2 cm进行处理，KI处理后用黑色塑料布对处理部位进行包裹使其避光。分别于ET处理后0、4、8、24、48、72 h采集胶乳，KI处理后0、6、24、48 h采集胶乳。选取3 a割龄的橡胶树品系热研7-33-97为材料，进行1% ET处理，采集割胶后5 min以内、5 min后至35 min、35 min后至停止排胶3个时间段的胶乳，分别记为T1、T2和T3，采集相应时间段不作处理的橡胶树胶乳作为对照。

通用植物总RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA eraser、PyrobestTM DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pMD18-T载体和DNA Markers等购自大连宝生物公司，SMARTTM RACE cDNA amplification kit购自Clontech公司，2×Es Taq MasterMix聚合酶购自北京康为世纪公司。大肠杆菌DH5α为本室保存。引物合成和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 橡胶树RNA和DNA的提取 按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取橡胶树各组织和各处理RNA。根据反转录试剂盒说明书步骤去除基因组DNA后进行cDNA第1链的合成。橡胶树叶片基因组DNA提取参照安泽伟等[18]的方法进行。

1.2.2 巴西橡胶树HbADF6基因序列克隆与分析 根据橡胶树树皮转录组测序获得的序列Unigene22074（GenBank登录号：JR366254）设计特异引物HbADF6F： 5'-TGAAGCTGCTTCTCTTCATTC-3'和HbADF6R： 5'-GGATTTGTCTCCCCTGAGG-3'，以橡胶树热研7-33-97胶乳cDNA为模板扩增ORF序列。根据Unigene22074序列设计3'RACE引物HbADF6-3R-GSP：5'-CAACATCTCGAATCCGAGCCA-3'和HbADF6-3R-NSP：5'-CTCTACAGAGATGGATCTTGAAG-3'，以热研7-33-97胶乳RNA为模板，按照试剂盒说明书扩增3'非翻译区。用Unigene22074序列在NCBI网站进行blastn比对，结果比对到橡胶树热研7-33-97基因组序列scaffold0706（GenBank登录号：LVXX01000706），利用引物HbADF6F与HbADF6R搭配，以橡胶树热研7-33-97基因组DNA为模板进行基因组序列扩增。PCR产物回收纯化后与pMD18-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定为阳性的克隆送公司测序。

1.2.3 HbADF6基因序列生物信息学分析 利用NCBI的ORF finder查找HbADF6基因的开放阅读框；利用在线软件ProtParam （http：//web.expasy.org/protparam/）对HbADF6基因编码蛋白的理化性质进行预测；利用ScanProsite工具（http：//prosite.expasy.org/scanprosite/）分析HbADF6基因编码蛋白序列保守结构域；利用SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM Server V. 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对HbADF6基因编码蛋白序列进行信号肽和跨膜域预测；通过在线工具PSORT （http：//psort.hgc.jp/form.html）预测HbADF6基因编码蛋白的亚细胞定位；在NCBI网站选用blastx比对同源序列，采用ClustalX 2.1进行多序列比对，采用MEGA5邻接法构建系统进化树；利用NCBI中Splign在线工具对HbADF6基因的OFR序列和基因组序列进行比对，确定HbADF6基因内含子和外显子的位置。

1.2.4 HbADF6基因表达分析 采用实时熒光定量PCR对HbADF6基因表达模式进行分析。根据HbADF6基因的cDNA序列设计特异引物HbADF6-qF： 5'-GACAGGTTCAGAAGGGAGCT-3'，并与HbADF6R引物搭配，以各处理和各组织cDNA为模板进行扩增。选用橡胶树18S rRNA基因（GenBank登录号：AB268099）为内参，设计特异引物Hb18S-qF：5'-GCTCGAAGACGATCAGATACC-3'和Hb18S-qR：5'-TTCAGCCTTGCGACCATAC-3'对相应模板进行扩增。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸s，共40个循环。相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.3 数据分析

试验所得数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 HbADF6基因的cDNA序列获得及分析

通过分析橡胶树的树皮转录组数据，结果发现Unigene22074序列比对到植物ADF基因。为验证胶乳中该基因序列的正确性，通过RT-PCR和RACE技术获得橡胶树胶乳中该基因的cDNA序列。序列分析显示该cDNA长999 bp，含有一个441 bp的开放阅读框，编码146个氨基酸，5'端非翻译区为177 bp，3'端非翻译区为381 bp，含有典型的真核生物加尾信号AATAAA和poly （A）尾，3'非翻译区与Unigene22074序列有4 bp差异。blastx比对结果显示，该基因翻译的氨基酸序列与木薯、麻风树、蓖麻、可可和木豆等植物ADF蛋白具有较高同源性（图1）。与毛果杨和拟南芥ADF6的一致性分别为92%和84%，因此将该基因命名为HbADF6。预测HbADF6基因编码蛋白分子量为16.88 ku，理论等电点为7.75。序列分析结果表明，HbADF6基因编码蛋白不具有信号肽和跨膜结构域，主要定位于细胞核，其中14～146位氨基酸序列为ADF-H结构域。

蛋白序列GenBank登录号分别为：木薯（OAY32632）、麻风树（NP_001294893）、蓖麻（XP_002524620）、拟南芥（NP_565719）、毛果杨（XP_002300779）、葡萄（XP_002285175）、可可（XP_007050307）、亚洲棉（XP_017623211）、木豆（XP_020212020）、小豆（XP_017442970）、桃（XP_007201857）、梅花（XP_008235687）。2.2 HbADF6基因组序列的获得及分析

以DNA为模板扩增得到1 680 bp的HbADF6基因组序列，与HbADF6 ORF比对后发现该序列包含3个外显子和2个内含子。3个外显子大小分别为24、266、151 bp，依次位于DNA序列（以起始密码子ATG为第1位）的1～24、588～853、1530～1 680位。2个内含子大小分别为563、676 bp（图2）。内/外显子剪接位点均符合GT/AG模式。

2.3 HbADF6蛋白系统进化分析

选取与HbADF6蛋白同源的15个ADF蛋白进行系统进化分析。结果表明，单子叶植物水稻（Q7XSN9）和谷子（KQK98402）的ADF蛋白聚为一组，双子叶植物橡胶树、木薯、毛果杨、拟南芥和葡萄等的ADF蛋白聚为一组（图3）。HbADF6蛋白属于双子叶植物亚类，与同属大戟科的木薯、蓖麻和麻风树亲缘关系最近。

2.4 HbADF6基因表达模式分析

实时荧光定量分析结果表明，HbADF6基因在所有检测组织中均表达，表达丰度由高到低分别为树皮、雌花、雄花、胶乳和叶片（图4-A）。与健康树相比，死皮橡胶树胶乳中HbADF6基因下调表达，其中5级死皮树胶乳中HbADF6基因的表达量最低（图4-B）。KI处理后胶乳中HbADF6基因的表达量逐渐升高，24 h达到最高，约为0 h表达量的4.64倍，随后降低（图4-C）。ET处理后胶乳中HbADF6基因表达模式与KI处理类似，同样为先升高后降低趋势。最高表达量出现在处理后48 h，约为0 h表达量的4.96倍（图4-D）。随着排胶时间的延长，对照胶乳中HbADF6基因的表达量逐渐下调，T3时段采集的胶乳中HbADF6基因的表达量最低。在整个排胶进程中，ET处理后的胶乳中HbADF6基因的表达量均高于对照，其中T2时段收集的胶乳中HbADF6基因的表达量最高，随后下调（图4-E）。

3 讨论

植物ADF基因的内含子数量和位置相对保守。拟南芥中的11个ADF基因均含有2个内含子和3个外显子。Nan等[19]将之分为4个亚类，其中第I和II亚类中的8个拟南芥ADF基因的第1个内含子紧邻ATG，第III和IV亚类的AtADF5、AtADF6和AtADF9基因的第1个外显子更长。值得注意的是，拟南芥第1个内含子含有假定的增强子基序，能影响基因转录表

达[20-21]。本研究获得的HbADF6与AtADF6基因序列一致性高达84%，同样具有2个内含子和3个外显子，两者的第1个外显子均为24 bp。根据ADF第1内含子的保守功能，推测HbADF6基因的第1内含子可能影响基因转录表达。与之前本项目组获得的HbADF基因序列[16]进行比较分析，结果发现HbADF6与HbADF基因的ORF序列及其推导的氨基酸序列一致性分别为64.17%和65.07%。HbADF基因也具有2个内含子和3个外显子，但第1个内含子位置与第I和II亚类中拟南芥ADF的第1个内含子位置一样紧邻ATG[17]。说明HbADF6与HbADF基因可能分属橡胶树ADF基因家族的不同亚类。Nan等[19]研究发现ADF可分为D-型活性（解聚F-肌动蛋白）和B-型活性（结合F-肌动蛋白），拟南芥AtADF6属于D-型活性。根据ADF功能的保守性，推测橡胶树HbADF6可能也属于D-型活性ADF，在橡胶树中主要执行解聚F-肌动蛋白功能。

死皮树割面乳管部分或全部堵塞，排胶量下降或完全停止排胶。实时荧光定量结果显示，与健康树相比，死皮树胶乳中HbADF6基因下调，其中5级死皮树中表达量最低。死皮树中HbADF6基因下调可能引起F-肌动蛋白解聚减少，促进“蛋白质网”形成，加快乳管堵塞，缩短排胶时间，防止胶乳过度流失。肌动蛋白微丝解聚剂KI调控胶乳中HbADF6基因表达，说明HbADF6基因可能参与KI解聚微丝的过程。5% KI引起橡胶樹死皮[13]，进一步说明HbADF6基因可能通过参与微丝解聚在橡胶树死皮过程中发挥作用。值得注意的是，胶乳中HbADF6与HbADF基因在不同死皮等级和KI处理条件下表达模式类似，说明HbADF6与HbADF基因可能通过解聚微丝在橡胶树死皮中发挥冗余功能。但HbADF6基因在2级死皮树胶乳中的表达量高于4级死皮树，而HbADF基因在2级死皮树胶乳中的表达量低于4级死皮树[17]。

ET作为生产中常用的增产刺激剂，能明显延长排胶时间[22]。ET处理后胶乳中HbADF6基因逐渐上调，直至处理72 h开始下调。这可能是ET诱导HbADF6基因上调表达，导致F-肌动蛋白解聚增加，延缓乳管伤口末端“蛋白质网”形成，从而延长排胶时间。邓顺楠[14]研究发现未处理对照和ET处理的橡胶树胶乳中肌动蛋白含量随着排胶进程均呈逐渐减少的趋势，但ET处理的橡胶树胶乳中肌动蛋白排出总量高于对照，整个排胶进程中ET处理的橡胶树乳管伤口处蛋白质聚集量明显低于对照。高政权等[13]通过罗丹明-鬼笔环肽染色法、邓顺楠[14]通过肌动蛋白免疫荧光定位法均发现割胶后肌动蛋白在乳管伤口末端逐渐聚集，推测胶乳中肌动蛋白可能在排胶过程中被逐渐截留在乳管伤口处。本研究结果发现在整个排胶进程中，ET处理的橡胶树胶乳中HbADF6基因表达量均高于对照，说明在排胶过程中ET可能通过诱导HbADF6基因来增加胶乳中F-肌动蛋白解聚活性，从而推迟“蛋白质网”形成，使得ET处理橡胶胶树排胶时间延长，导致胶乳中肌动蛋白排出量高于对照。值得注意的是，虽然ET处理诱导T2时段收集的胶乳中HbADF6基因上调表达，但T3时段HbADF6基因表达量下调。说明在整个排胶进程中ET并未一直诱导HbADF6基因上调表达，这可能是橡胶树为阻止乳管细胞成分过度流失和保障正常的胶乳再生能力，通过降低F-肌动蛋白解聚活性，促进“蛋白质网”形成以封闭乳管伤口，从而保护自身正常生长。

参考文献

[1] Staiger C J. Signaling to the actin cytoskeleton in plant[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2000，51：257-288.

[2] Roy-Zokan E M，Dyer K A，Meagher R B. Phylogenetic patterns of codon evolution in the actin-depolymerizing factor/cofilin（ADF/CFL） gene family[J]. PloS One，2015，10（12）：e0145917.

[3] Galkin V E，Orlova A，Kudryashov D S，et al. Remodeling of actin filaments by ADF/cofilin proteins[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（51）：20 568-20 572.

[4] Kim S R，Kim Y，An G. Molecular cloning and characterization of anther-preferential cDNA encoding a putative actin-depolymerizing factor[J]. Plant Mol Biol，1993，21（1）：39-45.

[5] Li X B，Xu D，Wang X L，et al. Three cotton genes preferentially expressed in flower tissues encode actin-depolymerizing factors which are involved in F-actin dynamics in cells[J]. J Exp Bot，2010，61（1）：41-53.

[6] Wang H Y，Wang J，Gao P，et al. Down-regulation of GhADF1 gene expression affects cotton fibre properties[J]. Plant Biotechnol J，2009，7（1）：13-23.

[7] Henty J L，Bledsoe S W，Khurana P，et al. Arabidopsis actin depolymerizing factor4 modulates the stochastic dynamic behavior of actin filaments in the cortical array of epidermal cells[J]. Plant Cell，2011，23（10）：3 711-3 726.

[8] Zhang B，Hua Y，Wang J，et al. TaADF4，an actin-depolymerizing factor from wheat，is required for resistance to the stripe rust pathogen Puccinia striiformis f. sp. tritici[J]. Plant J，2017，89（6）：1 210-1 224.

[9] Huang Y C，Huang W L，Hong C Y，et al. Comprehensive analysis of differentially expressed rice actin depolymerizing factor gene family and heterologous overexpression of OsADF3 confers Arabidopsis thaliana drought tolerance[J]. Rice，2012，5：33.

[10] Inada N，Higaki T，Hasezawa S. Nuclear function of subclass I actin-depolymerizing factor contributes to susceptibility in Arabidopsis to an adapted powdery mildew fungus[J]. Plant Physiol，2016，170（3）：1 420-1 434.

[11] 郝秉中，吳继林，谭海燕. 橡胶树乳管切割后的堵塞研究[J]. 热带作物学报，1996，17（1）：1-6.

[12] Hao B Z，Wu J L，Meng C X，et al. Laticifer wound plugging in Hevea brasiliensis：The role of a protein-network with rubber particle aggregations in stopping latex flow and protecting wounded laticifers[J]. J Rubb Res，2004，7（4）：281-299.

[13] 高政权，孟春晓，吴继林，等. 巴西橡胶树乳管肌动蛋白细胞骨架与采胶的关系[J]. 热带作物学报，2003，24（3）：22-26.

[14] 邓顺楠. 巴西橡胶树乳管伤口封闭物积累的研究[D]. 海口：海南大学，2013.

[15] 高政权，郝秉中. 植物细胞骨架在橡胶树产胶和排胶中的可能作用[J]. 海南师范学院学报（自然科学版），2001，14（2）：23-25.

[16] Deng Z，Liu X，Chen C，et al. Molecular cloning and characterization of an actindepolymerizing factor gene in Hevea brasiliensis[J]. Afr J Biotechnol，2010，9（45）：7 603-7 610.

[17] 鄧 治，刘向红，李德军. 橡胶树肌动蛋白解聚因子的表达和功能鉴定[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版），2016，42（2）：129-135.

[18] 安泽伟，黄华孙. 一种提取橡胶树叶片中总DNA的方法[J]. 植物生理学通讯，2005，41（4）：513-515.

[19] Nan Q，Qian D，Niu Y，et al. Plant actin-depolymerizing factors possess opposing biochemical properties arising from key amino acid changes throughout evolution[J]. Plant Cell，2017，29（2）：395-408.

[20] Ruzicka D R，Kandasamy M K，McKinney E C，et al. The ancient subclasses of Arabidopsis ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR genes exhibit novel and differential expression[J]. Plant J，2007，52（3）：460-472.

[21] Rose A B，Elfersi T，Parra G，et al. Promoter-proximal introns in Arabidopsis thaliana are enriched in dispersed signals that elevate gene expression[J]. Plant Cell，2008，20（3）：543-551.

[22] Coupé M，Chrestin H. Physico-chemical and biochemical mechanisms of the hormonal（ethylene） stimulation[M]//Auzac Jd，Jacob J L，Chrestin H（eds）. Physiology of Rubber Tree Latex. Florida：CRC Press，1989：295-319.