基于功能组分提升的药渣滤液培养技术研究

陈霞 胡留杰 聂铭 孙志洪 谢永红

摘   要   中药渣滤液已经成为制约中药材产业绿色发展的关键问题。以藿香正气液药渣滤液为原料，以YEM为菌剂，研究了其发酵基质、参数及发酵组分变化，以期为药渣滤液的快速微生物处理与高效利用提供技术支撑。研究结果表明，藿香正气液药渣滤液发酵培养基适宜配比为：添加蔗糖3%、硫酸铵0.3%、硝酸钙0.1%、复合氨基酸0.4%、磷酸二氢钾0.2%;适宜的菌种接种量为2%，适宜的培养温度为30 ℃，适宜的通气量为200 mL/（min·m3）。整个发酵期间，药渣水发酵液总黄酮含量增加36.9%，标志性药效成分从发酵前的10种增加到发酵后的16种，有8种主要药效成分的峰面积显著增加，药用组分峰面积增加40%，药效组分含量总体提高。

关键词   药渣滤液;菌剂;培养基;发酵;功能组分

中图分类号：Q946;S182    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.010

药渣滤液成分复杂，具有污染物浓度高、色度深、可生化性差、毒性强、难降解等特点，其处理利用一直是亟待解决的难点。传统药渣滤液处理沿用工业污水处理排放工艺，药效资源未能有效利用。目前制药废水处理技术主要包括吸附法、光降解法、膜分离法、厌氧法、好氧法等，以微生物厌氧、好氧及其组合工艺较为普遍。微生物发酵显著提高药渣滤液的有效组分和药效，在动物保健领域具有广泛的应用前景。韩春杨等利用由黄芪、党参、茯苓、山楂、麦芽和白术通过微生物发酵处理，发酵前后中药制剂液相色谱图对比表明，中药在发酵过程中，经过微生物的降解作用和细胞壁的分解，有效成分可以最大限度游离出来，使得药物成分有所增加，并且含量比发酵前升高了很多。但不同药渣滤液间其发酵微生物菌种、发酵基质与参数等均有所不同。本文以藿香正气液药渣滤液为原料，以前期筛选出的抗药性YEM菌株为菌剂，研究了药渣滤液发酵基质、参数等兼氧连续发酵工艺，同时对其组分变化进行了测定，为药渣滤液的快速微生物处理与高效利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

药渣滤液：取自太极集团涪陵制药厂藿香正气液药渣压榨水。药渣水颜色深褐色，pH值为6.5～6.8，悬浮颗粒含量1.2%～1.5%，COD为9 300～9 800 mg·L-1，TSS含量2.9%～3.1%，含总氮800～870 mg·L-1、总糖1 050～1 120 mg·L-1、总黄酮870～960 mg·L-1。试验菌剂为本课题组前期分离出的YEM菌剂。

1.2 试验方法

发酵培养基配方试验：按L16（45）正交表进行药渣滤液处理培养基配方试验。各因素和水平：蔗糖添加比例设置为2%、3%、4%、5%四个水平，硫酸铵添加比例设置为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%四个水平，硝酸钙添加比例设置为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%四个水平，复合氨基酸添加比例设置为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%四个水平，磷酸二氢钾添加比例设置为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%四个水平。将100 mL培养基装于250 mL三角瓶内，棉塞密封并121 ℃灭菌，冷却后每瓶培养基接种2 mL YEM菌剂活化液，于25 ℃培养5 d，取发酵液测定菌液OD550值。

发酵参数试验：利用优化培养基配方，在50 L发酵罐中设置1%、2%、3%菌种接种量，25 ℃、30 ℃、35 ℃培養温度，100， 200， 300 mL/（min·m3）充气量，进行单因素试验，每天取发酵液测定菌液OD550值。

药渣滤液发酵试验：在150 L发酵罐中，按最佳发酵参数与药渣滤液培养基配方进行发酵处理，每天取样测定菌液OD550值和进行组分检测。

1.3 测定指标和方法

发酵液光密度采用550 nm分光光度法测定;COD采用多参数水质分析仪测定;粗纤维含量采用重量法测定;粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定;总黄酮含量采用360 nm分光光度法测定。

发酵液组分测定：液相色谱法。将发酵前后的液体样品分别以8 000 r·min-1离心5 min，取上清液进行液相色谱测定。液相色谱条件如下。1）色谱柱，钻石C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;2）检测器，Waters2487紫外双波长检测器;3）流动相，A. pH值为3.25的磷酸溶液，B. 乙腈;二元梯度洗脱，洗脱条件为：0～5 min，A（%）10-10，B（%）90-90;5～25 min，A（%）10- 20，B（%）90-80;2～27 min，A（%）20-30，B（%）80-70 ;27～38 min，A（%）30-35，B（%）70 -65;38～40 min，A（%）35-40，B（%）65-60;40～50 min，A（%）40-40，B（%）60-60;检测波长：280 nm;检测柱温25 ℃;灵敏度0. 8AUFS;流速1 mL·min-1;样品进样量5 μL。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基配方筛选

发酵培养基配方试验结果（见表1）表明，各添加组分对菌株生长都有显著影响。根据试验结果的极差分析，在药渣水培养基中，硫酸铵和蔗糖的添加比例对发酵菌株的生长影响最大，其次是硝酸钙，复合氨基酸和磷酸二氢钾的添加比例对菌株生长的影响相对较小。从各添加组分的效应分析可知，药渣滤液发酵培养基适宜配比为：蔗糖3%、硫酸铵0.3%、硝酸钙0.1%、复合氨基酸0.4%、磷酸二氢钾0.2%。

2.2 药渣滤液发酵条件优化

2.2.1 温度

从图1可知，在25～35 ℃温度范围，发酵菌株在中药渣水培养基中均能正常生长，随着时间的增加，表现出先升后降的规律。与25 ℃培养条件相比，30 ℃培养的菌株活菌数量显著增加，菌株最大生长量在接种培养5 d到达，比25 ℃培养提前1 d;而35 ℃培养条件下，单培养基中活菌数量无明显增加，而且在发酵培养6 d以后菌株老化严重，活菌数量下降较快。可见，在药渣发酵处理中适宜的培养温度为30 ℃，可保障菌株在药渣水培养基的快速生长，保持菌株活性。

2.2.2 接种量

从图2可知，YEM菌剂3种不同接种量在药渣滤液培养基中菌株的生长速度差异明显，其中1%的菌种接种量启动速度慢，在7 d以后才达到较高的活菌密度;3%接种量处理提前达到活菌最大值，但后期菌株老化较快;2%菌种处理具有明显的菌株对数生长期，药渣滤液培养基中活菌数量多，稳定时期较长，利于药渣滤液的降解转化。因此认为，在药渣滤液培养基中适宜的菌种接种量为2%。

2.2.3 通气量

由于药渣水组分复杂，在微生物降解过程中需要厌氧和好养处理，才能降解木质素、纤维素和分解细胞壁，同时将粗蛋白转化为氨基酸等小分子物质。通过每间隔2 h通气10 min发酵罐内好养、厌氧循环处理过程，以进一步提高微生物对药渣滤液的处理效果。不同通气量试验结果见图3，可以看出，在低通气量100 mL/（min·m3）条件下，培养液中菌株生长缓慢，以厌氧菌为主要优势菌种;在高通气量300 mL/（min·m3）条件下，培养液中菌株前期生长快，而且活菌数量较多，以好养菌为主要优势菌种;在200 mL/（min·m3）条件下，培养液中菌株前期生长快，而且活菌数量最多，活性保持时间长。分析主要原因为适宜的通气量利于在发酵罐中形成稳定的厌氧和好养循环环境，利于各种菌株的生长，充分发挥厌氧菌和好养菌的降解功能。由此认为，在药渣滤液微生物发酵处理中，适宜的通气量为200 mL/（min·m3），利于形成稳定的厌氧和好养循环发酵环境。

2.3 药渣滤液微生物培养效果

采用150 L发酵罐在优化的药渣滤液培养基配方和发酵控制参数条件下进行药渣滤液微生物发酵处理，结果见表2。在药渣滤液培养基中发酵微生物菌株在发酵后4～5 d达到最大活菌密度，发酵液OD550达到1.83;随着培养液中养分的消耗降低，微生物数量逐渐减少。发酵液pH值从6.8下降到3.5左右，一直保持酸性状态，主要原因为发酵过程中产生大量乳酸。发酵液COD在发酵初期变化较小，与发酵液中微生物数量少、酶活性低有关;在发酵4 d后，发酵液COD显著下降，到第6天后COD维持在700 mg·L-1以下较低水平，呈缓慢下降趋势，在整个发酵处理过程中，COD下降94.6%。发酵液中纤维素的降解与COD变化规律一致，在整个发酵过程中纤维素降解率达97.3%，后期发酵液中纤维素含量低于45 mg·L-1。发酵液中粗蛋白含量随发酵时间的延长而增加，其增加速度与微生物数量增加基本同步，在整个发酵处理过程中，药渣滤液粗蛋白含量增加4～5倍，维持在1 100～1 280 mg·L-1范围。从发酵液中微生物生长及主要物质的降解动态分析，整个药渣水微生物处理周期为7 d以内。

2.4 药渣滤液发酵液组分与含量的变化

药渣水发酵液总黄酮含量的变化：由表2可见，药渣水在微生物发酵过程中总黄酮含量逐渐增加，尤其是发酵后4～6 d微生物数量和酶活性快速增加期间，发酵液总黄酮含量快速提高，后期稳定在1 250～1 280 mg·L-1范围，整个发酵期间，药渣水发酵液总黄酮含量增加36.9%。

药渣水发酵液组分的变化：对药渣水微生物发酵前后各组分液相色谱分离检测结果表明，绝大多数吸收峰的保留时间一致，其中7个主要药效成分保留時间一致。发酵后的制剂中标志性药效成分从发酵前的10种增加到发酵后的16种，有8种主要药效成分的峰面积显著增加，药用组分峰面积增加40%，表明药效组分含量总体提高，与发酵液中总黄酮含量增加36.4%的结果一致。

3 结论

用选育的YEM抗药性菌剂进行药渣废滤液发酵处理，通过正交试验优化获得药渣滤液发酵培养基适宜配比为：添加蔗糖3%、硫酸铵0.3%、硝酸钙0.1%、复合氨基酸0.4%、磷酸二氢钾0.2%。在pH值为6.5，2%菌种接种量，30 ℃培养温度和每间隔2 h通气10 min，通气量200 mL/（min·m3）条件下，药渣滤液发酵周期为7 d，实现药渣废滤液连续进料快速微生物处理;在药渣滤液功能组分提升定向培养过程中COD下降94.6%，纤维素降解97.3%，粗蛋白含量增加4～5倍，总黄酮含量增加36.4%，发酵液气味清香;通过发酵前后的药剂色谱图比较，绝大多数吸收峰的保留时间一致，发酵后的制剂中标志性药效成分从发酵前的10种增加到发酵后的16种，有8种主要药效成分的峰面积显著增加，药用组分含量总体提高40%左右;说明发酵处理增加了药渣水药效组分，提高了药效有关成分含量。