HPLC法·酶法和间苯二酚法检测生物制品中唾液酸含量方法学比较

秦湫红 朱爱华

摘要 [目的]比较高效液相色谱法（HPLC）、酶法及间苯二酚法测定唾液酸浓度的准确性、灵敏性和线性范围，探讨3种方法的实际应用特点。[方法]建立HPLC、酶法和间苯二酚法测定唾液酸浓度的方法，并分别使用3种方法同时测定同种生物制品中的唾液酸浓度。[结果]HPLC法线性范围为0.3～2 500.0 μg/mL，回收率为98.0%～99.2%，日内、日间RSD分别为0.8%～1.4%和1.6%～1.8%。酶法线性范围为0.6～20.0 μg/mL，回收率为102.0%～106.5%，日内、日间RSD分别为3.5%～4.2%和4.0%～4.6%。间苯二酚法线性范围为39～1 250 μg/mL，回收率为98.2%～100.2%，日内、日间RSD分别为2.9%～3.3%和3.0%～3.5%。[结论]3种方法回收率和精密度差异无显著性，但高效液相色谱法更加简单、便捷、成本低廉、灵敏度高且线性范围较宽，广泛适合生物制品中唾液酸含量测定。

关键词 唾液酸；高效液相色谱法；酶法；间苯二酚法；方法学

中图分类号 S131 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）20-0162-02

Abstract [Objective]The research aimed to determine the accuracy，sensitivity and linearity of sialic acid concentration by high performance liquid chromatography （HPLC），enzymatic and resorcinol methods，and discuss the practical application characteristics of the three methods.[Method]Establishing methods for the determination of sialic acid concentration by HPLC，enzymatic and resorcinol methods，and determining the sialic acid concentration in the same biological products using the three methods.[Result]The linear range of HPLC method was 0.3-2 500.0 μg/mL，and the recovery rate was 98.0%-99.2%，withinday and daytoday RSD were 0.8%-1.4% and 1.6%-1.8% respectively.The linear range of enzymatic method was 0.6-20.0 μg/mL，and the recovery rate was 102.0%-106.5%，withinday and daytoday RSD were 3.5%-4.2% and 4.0%-4.6% respectively.The calibration curve of resorcinol method was 39-1250 μg/mL，and the recovery rate was 98.2%-100.2%，Withinday and daytoday RSD were 2.9%-3.3% and 3.0%-3.5% respectively.[Conclusion]There is no significant difference among the three methods in terms of recovery and precision，but HPLC is more simple，convenient，inexpensive，sensitive，and has a wide linear range，which can be widely used for the determination of sialic acid in biological products.

Key words Sialic acid；High performance liquid chromatography；Enzymic method； Resorcinol method；Methodology

唾液酸（Sialic acid，SA）又称燕窝酸，是神经氨酸经N-乙酰化、O-乙酰化或N-羟乙酰化后的衍生物，其广泛存在于哺乳动物、脊椎動物及多种植物中的细胞膜表面，以糖苷键链接到糖蛋白或糖脂的末端，参与信号转导等多种生理功能[1]。唾液酸因具有提高人体免疫力[2]、提高记忆力和智力水平[3]以及抗痴呆[4]等作用而被广泛关注。已有研究表明，唾液酸表达水平与疾病发生也密切相关，在糖尿病、肾病、中枢神经系统疾病以及细菌感染的患者中唾液酸的表达水平出现明显异常[5]。目前唾液酸的含量测定有间苯二酚法[6]、酶法[7]以及高效液相色谱法[8]，但是这些方法都有自身的特点。该试验通过方法学研究这3种方法各自的优点和缺点，为不同生物样品唾液酸含量检测选择测定方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试液

唾液酸对照品[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；胎球蛋白[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]；唾液酸检测试剂盒[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]；间苯二酚、磷酸、邻苯二胺、盐酸、硫酸铜、乙酸丁酯、丁醇、乙腈为分析纯；高效液相色谱系统（戴安中国有限公司，型号UltiMate3000）；离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号TDZ6B-WS）；酶标仪（美谷分子仪器有限公司，型号Spectramax Plus 384）。

1.2 测定方法

1.2.1 标准溶液的配制。

精密称取唾液酸标准品25.0 mg，加0.5%磷酸溶液至5 mL，配制成5 000 μg/mL唾液酸标准品贮备液，并稀释成终浓度分别为2 500.0、1 250.0、625.0、313.0、156.0、78.0、39.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.3、0.6、0.3 μg/mL标准液。

1.2.2 HPLC法测定生物制品中唾液酸含量。

1.2.2.1 样品制备。

精密称取0.1 g奶粉溶于10 mL水中，混匀，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，除去上层油脂，或精密量取1 mL新鲜牛奶，加入磷酸至终浓度为0.5 %磷酸溶液并定容至10 mL，或精密称取10 mg胎球蛋白用0.5 %磷酸溶液溶解并定容至10 mL，于沸水煮沸30 min，室温冷却后取0.5 mL与10 mg/mL邻苯二胺溶液（0.5%磷酸溶液溶解）0.5 mL混匀，于60 ℃水浴40 min，置室温冷却。

1.2.2.2 含量测定。按照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温30 ℃以0.1%磷酸∶乙腈（90∶10）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，对照品溶液及样品溶液各进样20 μL，记录色谱图，按外标法以峰面积计算唾液酸含量。

1.2.3 酶法测定生物制品中唾液酸含量。

1.2.3.1 样品制备。精密称取0.05 g奶粉溶于10 mL水中，混匀，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，除去上层油脂，或精密量取0.5 mL新鲜牛奶，加入磷酸至终浓度为0.5% 磷酸溶液并定容至10 mL，或精密称取5 mg胎球蛋白用0.5% 磷酸溶液溶解并定容至10 mL，于沸水煮沸30 min，置室温冷却。

1.2.3.2 含量测定。按照唾液酸检测试剂盒操作方法，在样品中加入930 μL Tris Reaction Buffer，吸取反应溶液至比色皿中，将分光光度计在340 nm处调零，加入20 μL β-DADH Solution，反复吹打多次后在340 nm处读取初始β-DADH吸光度。将反应液重新吸回到原反应管中，加入1 μL N-Acetylneuraminic Acid Aldolase和1 μL L-Lactic Dehydrogenase，反复吹打多次后于37 ℃水浴至少1 h，吸取反应液至比色皿中，读取最终340 nm处吸光度。计算唾液酸含量。

1.2.4 间苯二酚法测定生物制品中唾液酸含量。

1.2.4.1 样品制备。精密称取1 g奶粉溶于10 mL水中，混匀，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，除去上层油脂，或精密量取10 mL新鲜牛奶，加入磷酸至终浓度为0.5%，或精密称取10 mg胎球蛋白用0.5%磷酸溶液溶解并定容至1 mL，于沸水煮沸30 min，置室温冷却。

1.2.4.2 含量测定。按照2015版《中国药典》三部通测3102唾液酸测定法，将样品100 μL置入10 mL玻璃试管中，每管加入间苯二酚-盐酸溶液（分别量取2%间苯二酚溶液2.5 mL、0.1 mol/L硫酸铜溶液62.5 μL、 25%盐酸溶液20 mL，加水稀释至25 mL，混匀）1 mL，加盖，沸水煮沸30 min，取出置冰浴中3 min后，没管加乙酸丁酯-丁醇液（取乙酸丁酯4份与丁醇1份混匀）2 mL，充分混匀，室温放置10 min，在波长580 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 HPLC法測定唾液酸含量线性关系 在“1.2.2.2”色谱条件下，唾液酸的保留时间为8.6 min峰形良好，分离完全。取标准溶液系列按“1.2.2.2”方法进行测定。以所测得的唾液酸峰面积为横坐标、相应的唾液酸浓度（μg/mL）为纵坐标做线性回归，

得出回归方程为Y=3.513 8X-1.247（R2=0.999 9），表明唾液酸在0.3～2 500.0 μg/mL线性良好。

2.2 酶法测定唾液酸含量线性关系 取标准溶液系列按照“1.2.3.2”操作。以所得的唾液酸光吸光度为横坐标、相应的唾液酸浓度（μg/mL）为纵坐标做线性回归，得出回归方程为Y=108.92X-4.192 7（R2=0.999 0），表明唾液酸在0.6～20.0 μg/mL线性良好。

2.3 间苯二酚法测定唾液酸含量线性关系

取标准溶液系列按照“1.2.4.2”操作。以所得的唾液酸光吸光度为横坐标、相应的唾液酸浓度（μg/mL）为纵坐标做线性回归，

得出回归方程为Y=3.743 5X-0.151 4（R2=0.999 6），表明唾液酸在39～1 250 μg/mL线性良好。

2.4精密度试验

取唾液酸标准溶液，用HPLC法检测10、20、39 μg/mL 溶液，用酶法检测5、10、20 μg/mL 溶液，用间苯二酚法检测20、39、78 μg/mL溶液，各每天检测5次，计算日精密度，连续检测5 d计算日间精密度。结果见表1。结果显示，3种方法均符合生物样品分析要求。

2.5 回收率试验

取3种检测方法各项下配制的奶粉1#样品溶液（唾液酸含量分别为15.75、7.93、156.80 μg/mL），分别加入同体积的唾液酸对照品20、10、156 μg/mL，分别用3种方法检测，计算回收率。结果显示（表1），3种方法均符合生物样品分析要求。

2.6 生物制剂样品中测定结果及比较 用3种方法检测不同生物制品中唾液酸含量，结果见表2，3种方法所测得的唾液酸浓度结果经t检验无显著差异（P>0.05）。

以HPLC测定值为自变量X、酶法测定值为函数Y进行线性回归，回归方程为Y=0.990 4X+0.015 8（R2=0.999 0），可见HPLC法与酶法的相关性良好。以HPLC测定值为自变量X、间苯二酚法测定值为函数Y进行线性回归，回归方程为Y=0.980 7X+0.025 8（R2=0.998 0），HPLC法与间苯二酚法的相关性良好。

3 讨论

目前检测生物制品中唾液酸浓度的方法有高效液相色谱法、酶法和间苯二酚法等。酶法测定生物制品中唾液酸浓度具有准确、灵敏度高的优点，但其成本较高，操作方法较为复杂，且线性范围较窄。间苯二酚法是《中国药典》收录的传统的测定唾液酸含量的方法，具有快速、准确、重现性好的优点，但其灵敏度较差，线性范围较窄。高效液相色谱法测定生物制品中唾液酸浓度具有快速、准确、重现性好、灵敏度高且线性范围较宽的优点，可广泛适用于生物制品中唾液酸含量的检测。

参考文献

[1] 李连生，刘克刚，姚祝军，等.唾液酸类化合物的合成研究进展[J].有机化学，2002，22（10）：718-734.

[2] BORK K，REUTTER W，GERARDYSCHAHN R，et al.The intracellular concentration of sialic acid regulates the polysialylation of the neural cell adhesion molecule[J].FEBS Lett，2005，579（22）：5079-5083.

[3] BRUSS J L，RUTISHAUSER U.Roles，regulation，and mechanism of polysialic acid function during neural development[J].Biochimie，2001，83（7）：635-643.

[4] 范劍.单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液治疗老年性痴呆45例[J].中国药业，2007，16（19）：59.

[5] 吴日余.酶动力学法测定尿唾液酸临床诊断初探[J].齐齐哈尔医学院学报，2005，26（11）：1302.

[6] 冯君，李宏基，韩立强，等.高效液相色谱法测定奶粉中唾液酸的含量[J].中国乳品工业，2008，36（6）：62-64.

[7] 戴谦，吴炯，郭玮，等.酶法检测唾液酸的性能验证及临床应用评估[J].中华检验医学杂志，2014，37（3）：189-193.

[8] 徐绯，宋紫玉.间苯二酚法测定重组人红细胞生成素原液唾液酸含量方法验证[J].黑龙江科技信息，2013（22）：5.