银龙鱼烂鳃病病原的分离和鉴定

史谢尧 贾文平 郝爽 张振国 罗璋 周文礼 冯守明

摘要 [目的]对患烂鳃病银龙鱼开展病原分离和鉴定。[方法]采用人工回归感染试验确定分离菌株的致病性，利用生理生化试验和16S rDNA 基因序列分析对病原菌进行鉴定。[结果]分离菌株YY-2017-3对斑马鱼具有致病性，其生理生化试验结果与柱状黄杆菌相一致；YY-2017-3菌株的16S rDNA基因序列与柱状黄杆菌聚为一支，对多种药物显示耐药。[结论]菌株YY-2017-3被鉴定为柱状黄杆菌，这是柱状黄杆菌引起银龙鱼烂鳃病在国内的首次报道。

关键词 银龙鱼；烂鳃病；病原菌；柱状黄杆菌

中图分类号 S941.42+4文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）15-0075-04

Abstract [Objective] To make the isolation and identification of pathogen from Osteoglossum bicirrhosum with gill rot disease.[Method] The pathogenicity of isolated strain was confirmed by artificial infection test，and the isolated strain was identified through physiological and biochemical tests，16S rDNA gene sequencing results.[Result] The isolated strain YY-2017-3 was pathogenic to zebra fish，and its physiological and biochemical properties were consistent with those of Flavobacterium columnare.YY-2017-3 strain formed a single cluster with 16S rDNA gene sequences of F.columnare，and it showed resistant to many kinds of antibiotics.[Conclusion]YY-2017-3 strain was identified as F.columnare.It was the first report about this bacterium caused gill roll disease of F.columnare in China.

Key words Osteoglossum bicirrhosum；Gill rot disease；Pathogen；Flavobacterium columnare

龙鱼是一类古老的大型淡水鱼，因其体形酷似我国神话中的龙，故俗称龙鱼，在分类上属于辐鳍鱼纲骨舌鱼目骨舌鱼科。龙鱼是地球上比较原始的鱼类，早在距今3亿多年前的远古石炭纪就已经存在，素有“活化石”之称[1]。目前，人工养殖的龙鱼品种主要有金龙鱼、银龙鱼和红龙鱼，其中以银龙鱼养殖数量和市场销量最大。银龙鱼鳞片较大，受光线照射时鳞片反射出银白色光辉，具有较高的观赏价值，深受观赏鱼爱好者喜爱，是一种名贵观赏鱼[2-3]。

近年来，随着养殖技术的不断发展，银龙鱼的人工培育和養殖技术逐步完善，广东、河北、天津等地养殖企业已开展银龙鱼苗的规模化培育并取得成功。2017年3月中旬，天津市宁河区某银龙鱼养殖场发生病害，患病银龙鱼体色暗淡无光泽，厌食，聚集于水体表层，对外界反应迟钝。笔者对患病银龙鱼进行了病原分离与鉴定，并对其进行了药敏试验，旨在为银龙鱼疾病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 患病银龙鱼（体长8.2～10.3 cm）来自天津市宁河区某观赏鱼养殖场；健康斑马鱼（体长3.2～4.1 cm）购自天津市中环观赏鱼市场。

Shieh培养基参照文献[4]的方法配制；微生物生化管和药敏片由杭州天和微生物试剂有限公司生产；LB培养基购自北京陆桥生物技术股份有限责任公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；rTaq、pMD 19T Vector，DNA Marker和Gel Extraction kit均购自TaKaRa公司。

1.2 病原的分离和寄生虫检查

用75%乙醇浸过的棉球对患病银龙鱼进行反复擦拭后，在无菌条件下对病鱼进行解剖，用接种环从患病鱼的鳃组织取少量样品划线接种于Shieh平板和LB平板，另外从肝、脾、肾等组织划线接种于LB平板和BHI平板；28 ℃培育48 h后，选取优势菌落进行进一步纯化，直至获得纯培养菌株。取患病银龙鱼的鳃丝、鳍条、体表黏液、肠道黏液、血液、肝脏、脾脏和肾脏等样品在显微镜下进行寄生虫检查。

1.3 病原的鉴定

1.3.1 生理生化试验。

将分离纯化后的YY-2017-3菌株划线接种于Shieh平板，28 ℃培养48 h后，观察其菌落形态。生理生化试验按参考文献[5-7]的方法进行。生理生化试验测定项目包括葡萄糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、鸟氨酸脱羧、精氨酸脱羧、赖氨酸脱羧、精氨酸水解、尿素、甘露醇、硫化氢、硝酸盐还原、枸椽酸盐、靛基质、七叶苷、明胶、触酶、氧化酶。

1.3.2 分子生物学鉴定。

参照文献[8]的方法进行分子生物学鉴定，以提取菌株YY-2017-3的基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA序列扩增的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGCTT-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系为：模板2 μL，上下游引物各0.4 μL（浓度10 μmol/L），2 × Mix 20 μL，补双蒸水至40 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。将PCR产物切胶回收，连接pMD-19T载体后，转E.coil TOP10感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。将测序结果与已登录GenBank数据库的序列进行同源性比对后，从GenBank数据库中下载相近种的16S rDNA序列，利用MEGA5.0软件进行多序列匹配排列，采用邻位相连法（Neighbor-joining） 构建系统发育树。

1.4 药敏试验 参照文献[9]的方法进行药敏试验，将YY-2017-3菌株接种在Shieh培养基中，在28 ℃、150 r/min培养48 h后，6 000 r/min离心集菌10 min，用无菌PBS将菌液浓度调整至1× 108 CFU/mL，取200 μL菌悬液均匀涂布于Shieh平板后，贴上药敏纸片，28 ℃培养48 h后，观察并记录抑菌圈直径，根据药敏纸片说明书的判定标准进行判定。

1.5 人工回归感染斑马鱼试验 将60尾健康斑马鱼（体长3.2～4.1 cm）随机分成2组，分别为感染组和对照组。将水温调节至28 ℃，24 h不间断曝气，暂养14 d后开始试验。感染组采用新鲜活化的YY-2017-3菌液浸泡感染，菌液终浓度为1.0 × 107 CFU/mL；浸泡1 h后，将斑马鱼捞出放回水族缸中饲养，对照组添加等量的Shieh培养基模拟浸泡感染。试验期间不喂食、不换水，观察感染后斑马鱼的活动情况，记录死亡鱼数量，及时捞走死鱼。对濒死的斑马鱼进行解剖，取鳃部组织在Shieh平板划线，根据科赫原则鉴定是否能再次分离到相同的细菌。

2 结果与分析

2.1 发病鱼症状

患病银龙鱼厌食、游泳异常、离群独游并常浮于水体表层，呈缺氧状态；体色暗淡、无光泽，鳃丝发白和部分腐烂。取少量鳃丝置于显微镜下观察，发现大量杆状细菌呈滑行运动。打开腹腔后，未发现内脏异常。

2.2 病原菌的分离和形态学观察

从患病银龙鱼的肝、脾、肾等组织中未分离到细菌，但从鳃部分离到1株细菌，暂定名为YY-2017-3。该菌株在Shieh平板上形成大小不一、边缘不整齐、假根状、中央较厚、干燥、淡黄色的菌落（图1）。

2.3 病原菌的鉴定

通过革兰氏染色，利用光学显微镜观察发现YY-2017-3菌株为革兰氏阴性杆菌，有时弯曲成半圆形，无芽胞（图2）。取菌悬液在显微镜下观察，发现其运动方式为滑行。生理生化试验结果表明，菌株YY-2017-3在尿素、硝酸盐还原、触酶、氧化酶、分解明胶反应中表现为阳性，其他均为阴性（表1）。

以YY-2017-3菌株的总DNA为模板，对其16S rDNA基因进行PCR扩增，得到 1 477 bp的核酸片段，完成测序后将序列在NCBI网站上进行同源性比对，发现其与Flavobacterium columnare strain CF2同源性最高，达99%。选用GenBank中已登录的部分黄杆菌属细菌的16S rDNA基因序列进行匹配排列，构建系统发育树，结果发现YY-2017-3菌株与柱状黄杆菌聚成一支（图3）。综合生理生化试验和分子生物学鉴定结果，可将YY-2017-3菌株鉴定为柱状黄杆菌。

46卷15期 史谢尧等 银龙鱼烂鳃病病原的分离和鉴定

2.4 回归感染试验 试验组30尾斑马鱼在感染第3天开始死亡，在感染后的7 d内全部死亡。对照组斑马鱼没有出现任何病症。人工感染后试验鱼表现为反应迟钝、离群独游、体色发黑。对濒死鱼进行解剖检查，发现斑马鱼鳃丝发白。从感染后的病鱼鳃部中再次分离致病菌，进行生理生化试验，其结果与菌株YY-2017-3相一致。

2.5 藥敏试验

由表2可知，在测定的16种抗生素中，菌株YY-2017-3除对氨苄青霉素和罗红霉素敏感外，对其他抗生素均显示出耐药或中度敏感。

3 结论与讨论

柱状黄杆菌是较早被发现和研究的鱼类病原之一，早在1922年Davis[10]就从患病细口鲈鱼（Micropterus dolomieui）和河鲈（Perca fluviatilis）中首次分离到该菌，并将其名为柱状芽孢杆菌（Bacillus columnaris）。1944年，该菌被Ordal等[11]从患病红鲑鱼（Oncorhynchus nerka）体内分离，并被命名为柱形粒球黏细菌（Chondrococcus columnaris）。1945年，Garnjobst[12]从牛头鱼（Ameiurus nebulosus）体表病灶分离到该菌，发现其形态特征与柱形粒球黏细菌相似，但在产子实体方面存在差异，将其命名为柱状噬纤维菌（Cytophaga columnaris）。卢全章等[13]于1975年从患烂鳃病的草鱼体内分离到柱状黄杆菌G4株，并将其命名为鱼害黏球菌（Myxococcus piscicola）。 随着细菌分类学研究的深入，对该菌的命名几经更改。1996年，Bernardet等[14]利用16S rDNA基因序列构建系统发育树，并结合生理生化特性进行综合判断，将其定名为柱状黄杆菌。曾用名有柱状粒球黏细菌、鱼害黏球菌、柱状噬纤维菌和柱状屈挠杆菌（Flexibacter columnaris），都是柱状黄杆菌的同物异名[7，14]。综上可知，对柱状黄杆菌的鉴定和命名，一直存在较大的争议。随着分子生物学的发展，细菌分类鉴定从传统的表型分类进入基因型分类水平。一般认为，16S rDNA同源性大于97.5%的菌株可视为同种[15]。为了对从银龙鱼体内分离的细菌进行鉴定，该研究采用分子生物学鉴定和生理生化试验相结合的方法。结果表明，分离菌株YY-2017-3的16S rDNA基因序列与柱状黄杆菌的同源性达到99%，并聚为一支，且生理生化特性与其他研究结果[6-7]相一致。综合考虑，可将分离菌株YY-2017-3鉴定为柱状黄杆菌。

柱状黄杆菌是一种常见的水产动物病原菌，其引发的柱形病又称之为细菌性烂鳃，病给我国水产养殖业造成巨大的经济损失[16-17]。柱状黄杆菌宿主极为广泛，草鱼、鳜、鲤、鲫等淡水鱼类都为易感品种，此外，也有从淡水观赏鱼中分离到该菌的报道[18]。笔者首次从银龙鱼中分离到柱状黄杆菌，药敏试验结果表明分离菌株对测定的16种药物中只有2种显示为敏感，这与其他研究结果[6，18]差别较大。尽管在不同的水域环境中同种细菌的药物敏感性可能存在差异，但该研究结果表明从银龙鱼中分离的柱状黄杆菌菌株对12种药物显示为耐药，且这些药物中部分药物为人用药物。由于银龙鱼价格昂贵，养殖户为了提高其存活率，可能存在频繁使用药物或滥用药物的情况，从而导致了菌株耐药性的提高。

为了有效防治柱状黄杆菌引发的疾病，国内外学者开展了广泛研究。陈昌福等[19]制备了柱状黄杆菌注射疫苗，该疫苗表现出较好的免疫效果，但由于注射免疫操作烦琐，限制了其广泛应用。2011年，美国农业部研制出柱状黄杆菌的减毒疫苗，通过浸泡免疫可获得较好的免疫保护效果[20]，但减毒疫苗的安全性问题一直存在较大的争议。王良发等[7]研究表明柱状黄杆菌至少存在3种基因型，不同基因型的柱状黄杆菌疫苗之间是否存在交叉免疫保护尚未确定。我国不同地区柱状黄杆菌的血清型可能存在地域差异。因此，对于高档鱼类，使用本地区分离的病原菌制备成“自家疫苗”进行注射免疫接种应成为今后发展的趋势。

笔者首次从银龙鱼中分离到柱状黄杆菌，扩大了柱状黄杆菌的宿主范围，也为柱状黄杆菌的进化分析、疫苗制备奠定了基础。该研究发现分离株YY-2017-3对多种药物显示耐药，但其耐药机制尚有待于进一步研究。

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