新疆回民自制酸泡菜中产转糖基活性β—半乳糖苷酶菌株的筛选和鉴定

张宇洁 王丽军 关波

摘要[目的]通过可培养的方式从泡菜中分离和筛选产转糖基活性β半乳糖苷酶（βgal）的菌株。[方法]以乳糖为唯一碳源，CaCO3溶钙圈和添加XGal的MRS筛选平板进行初筛，再通过oNPG法测定菌株βgal活性进行复筛，最后以粗酶液催化乳糖进行转糖基反应，通过TLC分析确认转糖基活性。[结果]通过3级筛选，得到具有转糖基活性βgal的菌株6株。结合其形态学、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析，确定筛选获得产转糖基活性βgal菌株中，5株为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），1株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。[结论]该研究可为以乳糖为底物高效合成功能性的低聚半乳糖提供新的酶源。

关键词泡菜;β-半乳糖苷酶;转糖基活性;乳酸杆菌;系统发育

中图分類号TS255.53文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0159-03

Screening and Identification of Strains Producing βgalactosidase with Transgalactosylation Activity from the Pickles of Hui in Xinjiang

ZHANG Yujie，WANG Lijun，GUAN Bo et al

（School of Food Science， Shihezi University，Shihezi， Xinjiang 832002）

Abstract[Objective]To isolate and screen the strains producing transglycosylated active βgalactosidase（βgal） from pickles by culturable methods. [Method]With lactose as the only carbon source， CaCO3 calcium solution and XGal MRS screening plate were screened， and the activity of strain βgal was rescreened by oNPG method. Finally， the glycosyl reaction was catalyzed by crude enzyme solution， and the activity of glycosyl group was confirmed by TLC analysis. [Result]A total of 6 strains of transglycosyl activated βgal were obtained by three stage screening. According to its morphological， physiological and biochemical characteristics and the homology analysis of 16S rDNA sequence， 5 strains of Lactobacillus fermentum and 1 strain of Lactobacillus plantarum were selected and obtained. [Conclusion]This study provides a new enzyme source for the efficient synthesis of functional Galacto oligosaccharides based on lactose.

Key wordsPickles;βgalactosidase;Transglycosylation activity;Lactobacillus;Phylogeny

β-半乳糖苷酶（β-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.23;βgal）能水解多糖或寡糖中的β-半乳糖苷键，一些β-半乳糖苷酶也能催化转糖基反应[1]。该酶可有效解决乳糖不耐症问题。乳酸菌来源的β-半乳糖苷酶是胞内酶，最适pH接近中性（pH 6.5 ～ 7.5），尤其适用于牛乳和乳清中乳糖的水解。乳酸菌作为β-半乳糖苷酶的来源，具有多种重要生理功能，作为食品级微生物，应用于食品工业具有“先天优势”，更容易被消费者接受。据相关文献报道，乳酸菌来源的β-半乳糖苷酶主要合成β（1→3）和β（1→6）等键型结构的低聚糖，应用于功能性低聚糖的生产比目前商业化的半乳寡聚糖[主要是β（1→4）键型]更易被肠道微生物所利用，具有更好的益生效果[2]。

目前为止，尽管具有转半乳糖基活性β-半乳糖苷酶的微生物来源广泛，但在食品工业获得批准使用并实现工业化生产的只有米曲霉和克鲁维酵母菌属等少数微生物[3-4]。因此寻找安全性更好、酶学性质更稳定，并具有一定生物技术特性的β-半乳糖苷酶成为该领域的研究热点。笔者对新疆回民自制酸泡菜中产转糖基活性乳糖酶的菌株进行了分离和鉴定，并对其乳糖酶的转糖基活性进行了初步分析。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料。

该试验所用泡菜取自新疆焉耆地区回民传统手工酸白菜。

1.1.2培养基。

MRS培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母浸膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1 mL/L，K2HPO4 2 g/L，醋酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，琼脂15 g/L（pH 6.2～6.4）。PY基础培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物10 g/L，盐溶液40 mL/L。明胶基础培养基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏 3 g/L，明胶120 g/L，pH 7.0～7.2。硫酸亚铁半固体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉3 g/L，酵母提取物3 g/L，硫酸亚铁0.2 g/L，硫代硫酸钠0.3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉12 g/L，调pH 7.4 。

1.2方法

1.2.1产βgal菌株的分离、初筛及纯化。

取泡菜样品适量于灭菌生理盐水中，37 ℃摇床2 h。用已灭菌的生理盐水稀释，选3个稀释度，每个稀释度取0.1 mL菌种稀释液，分别滴加到含2%碳酸钙的MRS平板上涂布，37 ℃培养24 h。接种环挑取溶钙圈单菌落于含XGal的筛选平板上划线分离，37 ℃培养24 h。挑取蓝色单菌落于MRS平板上划线纯化，37 ℃培养24 h。

1.2.2βgal酶活的测定。

1.2.2.1oNP标准曲线的绘制。取oNP标准品配制成1 mmol/L（1 μmol/mL）oNP母液，用pH 7.0的磷酸缓冲液稀释，每毫升分别含oNP 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、014 μmol，以pH 7.0的磷酸缓冲液为空白，测波长420 nm处吸光度，绘制标准曲线。

1.2.2.2βgal酶活力的计算。50 μL oNPG溶液（50 mmol/L pH 6.5）加入酶标板小孔中，再加入50 μL的粗酶液，于37 ℃下反应10 min，加入200 μL 0.5 mol/L的碳酸钠溶液终止反应，于420 nm波长处测定吸光值。

1.2.3βgal转糖基反应的TLC。

1.2.3.1转糖基试验。取500 μL用磷酸缓冲液（50 mmol/L pH 6.5）配制的20%乳糖溶液置于离心管中，水浴预热至37 ℃后加入1 mL粗酶液，37 ℃反应24 h后，沸水浴灭酶10 min，将样品用无水乙醇稀释至浓度为1 mg/mL。通过TLC分析低聚糖产量。

1.2.3.2TLC检测。取活化过的硅胶G玻璃板一块，用微量进样器点样，注意设置标准糖对照，用量约为毛细管1/3，上展层剂使用氯仿、冰乙酸和水的混合物（氯仿∶冰乙酸∶水=30∶35∶5），层析1 h，取出晾干后喷雾显色剂，置于烘箱中，85 ℃烘烤10 min，观察层析板上显现的不同顏色并比较，初步确认转糖基产物，从而获得产转糖基活性乳糖酶的菌株。

1.2.4产βgal菌株的鉴定[5]。

1.2.4.1菌株的形态特征。接菌于营养琼脂培养基37 ℃培养24 h，观察菌落形状、色泽、透明度等培养特征。挑取少许菌体进行革兰氏染色观察。

1.2.4.2

产βgal菌株的生理生化特性。过氧化氢酶试验;糖发酵试验;明胶液化试验;淀粉水解试验;硫化氢试验。

1.2.4.3产βgal菌株的分子鉴定。采用尿素法提取产酶菌株的基因组DNA[1]。采用16S rRNA基因通用引物27f和1492r扩增菌株的16S rDNA。将扩增PCR产物回收后与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α后，提取转化子质粒进行测序。序列比较分析建立系统发育树。

2结果与分析

2.1产βgal菌株的形态特征

从传统回民自制泡菜中分离纯化的菌株均为杆状，形成乳白色、圆形菌落，形态如图1b所示，在添加CaCO3的MRS平板上菌落周围具有明显的溶钙圈（图1a），革兰氏染色呈阳性（图1d），初步表明分离纯化的菌株应为乳酸菌菌株。将纯化获得的乳酸菌菌株接种到添加XGal的MRS平板上进行初筛，菌落变蓝则表明筛选获得的乳酸菌菌株能够产乳糖酶（图1c）。该研究共筛选获得产βgal菌株25株。

2.2产βgal菌株酶活的测定

2.2.1

oNP标准曲线的绘制。

以每毫升oNP的浓度为横坐标，以波长420 nm处测得的吸光度为纵坐标，得到oNP标准曲线，如图2所示。

2.2.2产βgal菌株的酶活。

采用oNPG法测定25株产酶菌株的酶活，25株初筛菌株的乳糖酶酶活见表1。从表1中可知，在相同培养基、接种量、培养温度37 ℃及培养36 h后不同菌株所得粗酶液的酶活最低为2.799 U/mL（PC-25），最高为26.289 U/mL（PC-17）。

2.3产βgal菌株粗酶液以乳糖为底物的TLC分析

对相同条件下处理的样品进行转糖基反应，通过TLC分析其产物如图3所示。得到6株具有转糖基活性的菌株，分别为PC-2、PC-4、PC-5、PC-8、PC-9、PC-10。

2.4产转糖基活性βgal菌株的生理生化特性

菌株的生理生化鉴定结果显示，6株菌均能发酵葡萄糖、乳糖，4号菌还可以发酵蔗糖、麦芽糖、甘露糖，6株菌均不能发酵阿拉伯糖、鼠李糖，且淀粉水解试验、明胶水解试验、硫化氢产生试验均为阴性，表明6株菌株在代谢过程中均不能分泌产生淀粉酶和尿素酶来降解大分子物质，也不能产过氧化氢和硫化氢。这些特征与乳酸杆菌的特征极为相似，综上初步断定6株菌为乳杆菌。

2.5序列分析

以筛选获得的具有转糖基活性乳糖酶菌株的16S rDNA序列与BLAST比对获得的具有相似性的16S rDNA序列构建系统发育树（图4），表明筛选获得的产转糖基活性乳糖酶的菌株均为乳酸杆菌属（Lactobacillus）菌株，其中5株为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），1株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

3讨论

该试验以新疆回民自制酸泡菜为研究材料，利用CaCO3溶钙圈和添加XGal的MRS筛选平板进行初筛获得产乳糖酶的疑似乳酸菌菌株25株;以浓度20%的乳糖为转糖基反应底物与适量粗酶液反应，产物采用TLC技术鉴定，获得产转糖基活性乳糖酶的菌株6株。采用革兰氏染色、糖发酵试验、淀粉水解试验、16S rDNA序列技术等7种方法对菌株进行了鉴定，得出了产转糖基活性乳糖酶菌株的种属关系，确定其中5株为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），1株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

目前，產低聚半乳糖微生物酶的使用是国际半乳寡聚糖生产的趋势，现已有多种不同的产转糖基化β-半乳糖苷酶微生物的研究，并且还在发展和寻找新的微生物酶源[6]。乳杆菌属于益生菌，其广泛存在于动物肠道、含碳水化合物的动植物发酵制品中，过去人们更加注意乳酸杆菌和双歧杆菌对乳糖水解活性的研究，而对转糖基活性提高发酵乳制品质量的研究很少。近年来，双歧杆菌及乳杆菌来源的转糖基活性β-半乳糖苷酶由于具有独特的转糖基特性，逐渐受到关注[7-10]。该研究筛选的产转糖基活性β-半乳糖苷酶的植物乳杆菌和发酵乳杆菌，为以乳糖为底物高效合成功能性的低聚半乳糖提供了新的酶源。

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