碱法絮凝采收聚球藻7002的研究

黄敏　冯广鑫　朱素芹　吴浩浩

摘要 [目的]探究碱法絮凝采收聚球藻7002的效果和机制。[方法]通过研究不同pH、沉降时间和藻细胞浓度对絮凝效果的影响，确定碱法絮凝聚球藻7002的最佳条件，通过检测藻体Zeta电位和藻体沉淀中Ca2+和Mg2+的浓度，分析碱法絮凝收集聚球藻7002的机制，并根据采收的藻细胞的生长情况，评估碱絮凝方法的安全性。[结果]碱法絮凝采收聚球藻7002的最佳pH和沉降时间分别为10.5和120 min，采收过程不受藻细胞浓度的影响。当絮凝pH 为10.5时，藻体Zeta电位（绝对值）最低，Mg（OH）2沉淀大量形成，并通过正负电荷中和作用诱导藻细胞絮凝。此外，pH 10.5的絮凝条件不会对藻细胞的生理活性产生明显影响。[结论]该试验得到了一种经济高效采收聚球藻7002的方法。

关键词 微藻；聚球藻7002；采收；碱法絮凝；絮凝效率

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）18-0009-04

Alkaline Flocculation for Harvesting Synechococcus sp. PCC 7002

HUANG Min， FENG Guangxin， ZHU Suqin et al

（College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao， Shandong 266003）

Abstract [Objective] To study the effect and mechanism of alkaline flocculent of Synechococcus sp. PCC 7002. [Method] The effects of pH， settling time and biomass concentration on flocculent efficiency were studied to obtain the optimal flocculent condition. Zeta potential of algal and Ca2+ and Mg2+ concentrations in the sediment were determined to analyze the mechanism of alkaline flocculation of Synechococcus sp. PCC 7002. The growth of harvested cells were also examined to evaluate the safety of alkaline flocculation. [Result] The optimal pH and settling time were 10.5 and 120 min， respectively， and the alkaline flocculation was not affected by biomass concentration. When pH was 10.5， the Zeta potential of the algae was the lowest and the charge neutralization between Mg（OH）2 precipitate and algal cells was found to be the main mechanism of alkaline flocculation of Synechococcus sp. PCC 7002. Additionally， the flocculation at pH 10.5 had no significant effect on the physiological activity of the harvested Synechococcus sp. PCC 7002. [Conclusion] The present study provided a costeffective method to harvest Synechococcus sp. PCC 7002.

Key words Microalgae；Synechococcus sp. PCC 7002；Harvesting；Alkaline flocculation；Flocculent efficiency

微藻是一種光合自养微生物，具有易于人工培养、光合作用效率高、生长周期短、单位时间内生物量高等优点。微藻富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、色素等多种活性物质，可用于生产高附加值产品[1]。另外，其在环境保护领域也发挥了重要作用，如生物修复废水、减排CO2等[2-4]。因此，有望用于缓解由人口增加、耕地面积减少、环境污染等因素造成的原料不足的问题[5]。微藻培养及采收成本高是制约其产业化的关键[6-7]。另外，微藻细胞体积小、培养密度低、细胞表面带负电荷，可均匀、稳定地分散于培养液中，给集中采收带来许多困难[8]。建立高效的采收技术对降低微藻生产成本有重要意义。

目前采收方法主要有过滤法、气浮法、离心法及絮凝法等[9]。这些方法中，絮凝法一直以设备投资少、分离过程简单、易于快速处理大量藻液而被广泛应用[10]。其原理是通过电中和减少藻细胞间的静电斥力，使单个藻细胞形成较大的聚集物，再通过重力沉淀与培养介质分离而采收。通过投加碱液，调节藻液的pH，使藻细胞发生自絮凝称为碱法絮凝，该方法具有低成本、能耗小和无化学污染等优点[11]。因此，碱法絮凝是一种较理想的采收方法。

笔者以聚球藻 7002（Synechococcus sp.PCC 7002）为研究对象，探索了碱法絮凝收集该微藻的效果，并探讨了相关机理，为碱法絮凝的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1

材料。聚球藻 7002由北京大学生命科学学院赵进东院士惠赠。培养基采用Medium A（pH 8.2），培养于100 mL三角瓶中，摇瓶培养15 d，条件为150 r/min、30 ℃、光强8 000 lx，OD750反映聚球藻7002的生物量[12]。氢氧化钠购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2

仪器。TS-211GZ 光照恒温摇床（上海仪纯实业有限公司）；S210-K pH计（METTLER TOLEDO）；TGL-20B 高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Power Wave XS2酶标仪（Gene Company Limited）；Zetasizer Nano ZS 90 纳米粒度电位仪（Malvern Instruments）；DigiBlock ED36电热消解仪（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；AA-6880F/AAC原子吸收分光光度计（Shimadzu Corporation）。

1.2 絮凝试验

取10 mL聚球藻7002藻悬液置于15 mL离心管中，用5 mol/L氢氧化钠溶液将藻悬液pH分别调至95、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0，室温静置120 min后取离液面深1 cm处的液体，在750 nm处测定其吸光值。絮凝效率通过式（1）计算。取10 mL聚球藻7002藻悬液置于15 mL离心管中，在8 000 r/min条件下离心 10 min后，取离液面深1 cm处的液体，在750 nm处测定其吸光值作为对照。

絮凝效率=（1-A/B ）×100%（1）

式中，A为藻液絮凝结束后OD750；B为藻液初始OD750。

1.3 pH 10.5絮凝聚球藻7002条件的确定

1.3.1

沉降时间。研究pH 10.5条件下，沉降时间对聚球藻7002絮凝效果的影响。用5 mol/L氢氧化钠溶液调节藻液pH为10.5，连续300 min跟踪测定上清体积变化，以上清体积占藻液总体积的百分比为指标确定聚球藻7002在pH 10.5条件下完全絮凝的时间。

1.3.2

藻细胞浓度。研究pH 10.5条件下，藻细胞浓度对聚球藻7002絮凝效果的影响。用5 mol/L氢氧化钠溶液调节藻液pH为10.5，藻液中湿藻含量分别为4、8、12和16 g/L，静置120 min后记录絮凝效率。

1.4 Zeta 电位测定

取1 mL不同pH絮凝后藻液置于U 型比色皿中，放入纳米粒度电位仪中进行检测。

1.5 Ca2+和Mg2+濃度测定

离心（8 000 r/min、10 min）后上清液以及pH 10.5、11.0和11.5絮凝后的上清液经过0.22 μm滤膜过滤备用，藻体沉淀分别重悬于等体积的超纯水中，并在550 r/min条件下振动60 min，使藻体分散均匀。量取5 mL重悬后的藻液于玻璃消解管中，加入15 mL消化液（高氯酸∶硝酸=1∶4），利用电热消解仪（DigiBlock ED36，北京莱伯泰科仪器股份有限公司）进行消化。取Ca 和Mg 标准储备液（1 mg/mL），用1 mol/L HNO3稀释成1、2、3、4、5 mg/L的Ca标准系列工作溶液和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L的Mg标准系列工作溶液。用原子吸收分光光度计（AA-6880F/AAC，Shimadzu Corporation）测量标准系列吸光度，绘制标准曲线。并在相同条件下测定和计算上清液、藻体消化液中Ca2+和Mg2+的含量。

1.6 碱法絮凝收集聚球藻7002的安全性评估试验

将pH 10.5、11.0和11.5絮凝120 min的聚球藻7002重新接种到新鲜的培养液中，离心（8 000 r/min、10 min）获得的聚球藻7002作为对照，连续14 d测定聚球藻7002在750 nm处的吸光值。采用修正Gompertz方程，对聚球藻7002的生长动态进行拟合，即一级模型。Gompertz方程如下：

lgN（t）=lgN0+lgNmaxN0×expμmax×2.718lg（Nmax/N0）×（Lag-t）+1（2）

式中，N（t）为培养时间为t时的聚球藻的密度（OD750）；N0和Nmax分别为初始和最大聚球藻7002的密度（OD750）；μmax为最大比生长速率（d-1）；Lag为延滞时间（d）；t为培养时间（d）。

1.7 数据统计分析

数据均以平均值 ± 标准偏差（n=3）来表示。采用最小显著差异法（the least significant difference，LSD），在SPSS 19.0统计软件中比较、分析均值的差异性，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 碱法絮凝收集聚球藻7002条件的确定

聚球藻7002在不同高pH条件下静置120 min的絮凝效率如图1A所示。培养基pH为10.0时，聚球藻7002的絮凝效率较低，为13.8%；当pH升高至10.5时，絮凝效率得到显著提高（P<0.05），达87.8%；当培养基pH为11.0时，絮凝效率达96.7%，继续提高培养基的pH，絮凝效率无显著性变化。研究表明，离心方法可以有效采收微藻[13]，pH 10.5絮凝后的上清在750 nm处的吸光值与8 000 r/min条件下离心 10 min后上清的吸光值相同，说明pH 10.5可以有效地絮凝聚球藻7002。当pH≥11.0时，絮凝效率提高可能是由于培养基中杂质也被絮凝沉淀。由图1B可知，pH 10.5时絮凝速度最快；当pH≥11.0时，絮凝120 min后，藻体依然没有完全沉淀；pH 12.0絮凝后藻体颜色变黄，说明藻细胞生理活性明显受到损伤。

Blanchemain等[14]分析，在高pH环境下，絮凝时间会影响藻细胞的生命活力。为了确定pH 10.5絮凝聚球藻7002的最佳沉降时间，连续300 min跟踪测定上清体积的变化。由图2可知，随着絮凝时间增加，上清体积逐渐增加，当絮凝至120 min时，上清体积占总体积的60.3%，继续延长絮凝时间，上清体积增加不显著。

在摇瓶培养条件下，稳定期的聚球藻7002湿重达4 g/L。实际上，絮凝过程中会遇到不同浓度的藻液，为了评价藻细胞浓度对pH 10.5诱导聚球藻7002絮凝效果的影响，研究了pH 10.5对湿藻含量为4、8、12、16 g/L藻液的絮凝效果。由图3可知，藻细胞浓度对碱法絮凝聚球藻7002的效果无显著影响。

2.2 Ca2+和Mg2+在碱法絮凝中的变化

由图4可知，碱法絮凝之前，99%的Ca2+和Mg2+存在于上清中。pH 10.5絮凝后，上清中Ca2+以及藻体沉淀中Ca2+浓度几乎没有改变；而上清中Mg2+大量减少，藻体沉淀中Mg2+增加了26%，且此时藻细胞几乎完全被絮凝（图1）。当絮凝pH≥11.0时，随着pH增大，上清中Ca2+和Mg2+浓度逐渐降低，藻体沉淀中Ca2+和Mg2+浓度逐渐升高。

2.3 pH对藻体Zeta电位的影响

从图5可以看出，碱法絮凝之前，藻体Zeta电位为-15.33mV，说明聚球藻7002细胞

表面带负电荷；当培养基pH <10.5时，随着培养基pH增加，藻体Zeta电位（绝对值）变化不显著；当培养基pH为10.5时，藻体Zeta电位（绝对值）迅速降低，达到最低值，说明藻细胞表面的负电荷被中和；当培养基pH >10.5时，随着培养基pH继续增加，藻体Zeta电位（绝对值）有上升的趋势。

2.4 碱法絮凝收集聚球藻7002的安全性评估

碱法絮凝和离心获得的聚球藻7002藻细胞的生长情况如图6所示，诱导藻细胞絮凝的pH越低，絮凝后藻细胞的生长状态越接近离心获得的藻细胞。用修正Gompertz方程拟合藻细胞生长曲线，求出藻细胞的动力学参数，对照组和pH 10.5、11.0和11.5曲线的相关系数分别为0.998 8、0.997 9、0.997 3和0.981 8，证明曲线拟合有效（表1）。在pH 10.5条件下，聚球藻7002生长，其延滞期、最大生长速率和最大藻体密度与对照相比均无显著差异（P>0.05）；在pH 11.0条件下，聚球藻7002的延滞期与对照无显著差异，但是最大生长速率和最大藻体密度显著低于对照组（P<0.05）；在pH 11.5条件下，第2天的藻体密度反而比初始数值低，之后开始增长加快，其延滞期为3.085 2 d，是对照组的2.37倍，最大藻体密度显著低于对照组（P<0.05）。

3 结论与讨论

该研究中，pH 10.5可迅速实现微藻的絮凝。Pérez 等[15]认为，当培养基pH为11.0、11.5和12.0时，中肋骨条藻和纤细角毛藻的絮凝效率为90%以上；Yang等[16]认为，利用氢氧化钠增加培养基pH，小球藻的絮凝效率达90%。这说明碱法可有效实现微藻的絮凝，降低采收成本。在高pH条件诱导下，Ca2+和Mg2+等离子起重要作用[17]。pH 10.5絮凝聚球藻7002后，上清中Ca2+以及藻体沉淀中Ca2+浓度几乎没有发生改变，而上清中Mg2+浓度减少，藻体沉淀中Mg2+浓度增加。另外，Vandamme等[18]发现，在高pH诱导小球藻絮凝试验中，Mg2+（≥ 0.15 mmol/L）是必不可少的；Wu等[19]研究了高pH诱导绿球藻等淡水微藻以及三角褐指藻等海洋微藻的絮凝效果，结果表明，微藻絮凝后培养基中Mg2+浓度显著下降。以上研究说明Mg2+在碱法絮凝收集微藻过程中起着重要作用。

当pH为10.5时，藻体Zeta电位（绝对值）迅速降到最低值，根据此时Mg2+浓度变化情况分析其原因，应该是此时培养基中的Mg2+形成了表面带正电荷、吸附面积较大的Mg（OH）2沉淀，并吸附了表面带负电荷的藻细胞，使藻细胞间的静电斥力减小，藻体Zeta电位（绝对值）降低，从而致使藻液均匀、稳定的状态被打破，单个细胞发生聚集，在重力的作用下沉降达到絮凝效果[20]。另外，Mg（OH）2具有相当开放的结构，即使在低浓度的情况下，也可以有效诱导藻细胞的絮凝[19]，这也解释了pH 10.5絮凝聚球藻7002不受藻细胞浓度影响的结果。当絮凝pH >10.5时，藻体Zeta电位（绝对值）有上升的趋势，这表明微藻细胞表面的羧酸基团被解离，从而使絮凝体间的静电斥力增大，絮凝沉降的速度较pH 10.5时显著降低。

根据采收的藻细胞生长情况和生长动力学参数可以看出，采用pH≥11.0的條件对聚球藻7002进行絮凝时，藻细胞的生理活性受到损伤，致使藻细胞适应环境的能力下降，严重影响了其后续的生长增殖，pH 10.5时，对微藻细胞后续生长繁殖无显著影响。

该试验通过分析碱絮凝法，获得聚球藻7002的最佳絮凝条件为pH 10.5，最佳沉降时间为120 min，絮凝过程不受微藻浓度的影响。该结果可为聚球藻7002的规模化培养和采集提供理论依据。

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