卷烟加工及储存过程中细菌群落组成及变化研究

陈兴　杨莹　李珊辉

摘要[目的]研究卷烟加工及储存过程中细菌群落结构以及多样性的变化。[方法]采用二代高通量测序平台，以云烟（软珍，R）不同制丝工艺的加工工序及储存过程的烟叶表面微生物为研究对象，对其进行16S rRNA 基因高通量测序。[结果] 尽管不同制丝工艺在相同加工工序中微生物群落丰富度不尽相同，但主要高丰富度微生物类群的种类比较一致；此外，烟叶在不同城市的不同储存时间下，微生物类群的变化具有类似的趋势。[结论]该研究对从微生物角度改进烟叶制丝工艺具有一定的借鉴意义，同时表明烟叶的储存时间可能是影响微生物后期群落发生变化的主要因素。

关键词制丝工艺；高通量测序；微生物群落结构；烟叶品质

中图分类号TS452文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）08-0015-04

Effects of Cigarette Processing and Storage Process on Bacterial Community Structure

CHEN Xing1，YANG Ying1，LI Shanhui2，3 et al（1.Technology Center，China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming，Yunnan 650231；2.School of Life Science，Sun YatSen University，Guangzhou ，Guangdong 510275；3.Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Kunming ，Yunnan 650091）

Abstract[Objective]In order to study the changes of bacterial community structure and diversity in cigarette processing and storage process [Method]The two generation highthroughput sequencing platforms were used to study the processing technology of Yunyan tobacco （R） and the surface microorganism of tobacco leaves during storage.The 16S rRNA gene was sequenced by highthroughput sequencing.[Result]Although different technics in the same processing in the process of microbial community richness was not the same，but the main types of high richness microbial communities were consistent.In addition，the results also showed that the storage time of tobacco leaves could be the main factor affecting the changing of microbial community rather than the cities where they storage.[Conclusion]The study has a certain reference significance for improving tobacco processing technology from microorganism angle.Meanwhile，it indicates that the storage time of tobacco leaves may be the main factor that affects the later stage of microbial community.

Key wordsCigarette processing；Highthroughput sequencing；Microbial community structure；Tobacco quality

卷烟是用特定的技术和设备将烟草原料和辅助材料加工制作成消費者可吸食商品的过程。根据烟叶原料的性质，卷烟生产的工艺流程是通过各种加工方法或设备逐步把烟叶原料和其他辅助材料制成合格卷烟产品所必须经过的加工制造过程。该流程包括的主要工艺除制丝外，还包括卷接和包装。有研究表明，烟叶在生长和调制过程中均有微生物在烟叶上生长，其微生物种类和数量会随着烟叶品种、产地、等级、调制方式的不同而存在一定差异。对于烟叶表面微生物群落的研究始于1933 年，Reid等[1]首次发现雪茄烟叶表面具有大量的细菌和霉菌，其主要的细菌类群是巨大芽孢杆菌，而主要的霉菌类群为曲霉和青霉。Tamayo等[2]从西班牙烟叶中分离出的微生物主要是球菌和芽孢杆菌。谢和等[3]从烤烟中分离到了放线菌、细菌和霉菌，但未发现酵母菌。邱立友等[4]的研究发现，烤烟NC89在自然醇化过程中烟叶表面存在着占有绝对优势的细菌和数量较少的霉菌和放线菌。王革等[5]在国内初次从自然发酵的烟叶上分离到酵母菌。研究结果均表明，发酵烟叶表面微生物群落的多样性较丰富，尽管细菌、霉菌和酵母菌等均有存在，但以细菌群落为主，且细菌中的芽孢杆菌所占的丰富度较高。烟叶品质发生复杂变化的主要特征是烟叶中化合物的分解与转化，其中影响烟叶香气和吸味品质的重要过程是将不具备香味特性的大分子物质，如氨基酸、蛋白质、高级脂肪酸、纤维素、还原性糖和烟碱等化合物，转化为各种挥发性酸或挥发性香气成分的小分子化合物[6]。此过程中，微生物在烟叶品质和口味的改变过程中发挥着举足轻重的作用。然而，对于烟叶加工及储存运输过程烟叶表面微生物多样性研究较少，这就使得实际工业应用中缺乏科学依据。

笔者通过高通量测序技术，以卷烟加工及储存中的不同过程下的细菌群落为研究对象，对其组成及变化进行研究，以期通过对烤烟烟叶表面微生物进行全面、系统的认知，充分了解烟叶品质变化过程中烤烟烟叶表面微生物群落结构的变化，从而认知微生物群落变化与烟叶品质改变之间的关系，为烟叶品质的调控和微生物资源的挖掘提供科学指导。

1材料与方法

1.1材料及设计

该试验所用到的云烟（软珍，代号R）卷烟由云南中烟工业有限责任公司提供。根据制丝工艺的不同，分为薄板模块（代号B）和气流模块（代号Q），所有样品均来自这2个卷烟制丝工艺的各个加工工序，样品信息如表1所示。

表1中原料烟叶（代号01）是指陈化完成后待加工的片状烟叶，片状烟叶经过长时间的陈化过程被挤压成块状，这个时期的烟叶水分含量较少。在松散回潮工序（代号02）中，烟叶在加入水蒸气后充分吸收水分而变得松软，然后通过机械的方式把结成块状的烟叶抖散，烟叶充分分散之后开始进入加料工序。制丝过程中加料分2次进行（一加入口，代号03；一加出口，代号04；二加入口，代号05；二加出口，代号06），料液的加入使烟叶的耐加工性能和感官品质提高。储存柜的作用是待加料工序完成后，烟叶在储柜中储存，使料液和烟叶充分作用。烟叶从橱柜取出后（代号07），烟叶经过切丝工序后进入烘丝工序。烘丝完成后（代号08），再经过冷却后（代号09），最终进入添加香精香料的加香工序。

研究所用R牌号卷烟的储存方式根据城市的不同和放置时间的不同进行取样，并以刚刚包装成型的卷烟产品作为对照，具体样品信息如Rcontrol*（对照），RM01*、RM02*、RM03、RM04、RM05、RW01*、RW02*、RW03、RW04、RW05、RH01、RH02*、RH03、RH04、RH05、RK01、RK02*、RK03、RK04、RK05。样品制备和采集时均带一次性无菌聚乙烯（PE）手套进行操作，取样完成后，立即用无菌封口袋包扎密封，放入-80 ℃冰箱保存备用。

对于不同城市放置不同时间的未拆封卷烟产品样品分别来自牡丹江市（代号M）、乌鲁木齐市（代号W）、海口市（代号H）和昆明市（代号K），在各个城市的放置时间分别为7 d（代号01）、30 d（代号02）、120 d（代号03）、180 d（代号04）和360 d（代号05），“*”代表样品是由Roche 454 GS FLX+平台进行测序，而其余样品在Illumina Miseq平台下测序。

1.2方法

1.2.1样品表面微生物的收集及宏基因组DNA的提取。

参考2009年Zhao等烟叶表面微生物的收集方法[7]，根据烟叶的实际情况作了部分改良，且所有步骤均保证在无菌条件下进行。DNA的提取采用土壤DNA提取试剂盒（PowerSoil DNA Isolation kit，code：12888-100）对收集的各个烟叶表面微生物样品进行DNA提取，提取过程参照试剂盒的操作说明进行了相关优化[8]。

1.2.216S rRNA基因PCR扩增及测序。

该研究中，所有PCR扩增引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。对于Roche 454 GS FLX+平台测序的样品，采用融合barcode序列的V6F3引物（5′CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGbarcodeTGCAACGCGAAGAACCTTACC3′）和V8R2引物（5′CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCCCGGGAACGTATTCACCG3′）进行扩增。PCR反应体系包括：10×PCR buffer 5.0 μL；dNTP（10 mmol/L each） 0.5 μL；Genomic DNA 10 ng；BarPCR primer F（50 μmol/L） 0.5 μL；Primer R （50 μmol/L）0.5 μL；Plantium Taq（5 U/μL） 0.5 μL；ddH2O加至50.0 μL。

反應条件如下所示： 94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s，5个循环；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s，20个循环；72 ℃、5 min；10 ℃、 ∞。

对于在Illumina Miseq 300PE平台测序的样品，采用融合barcode序列的引物341F（5′CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNbarcodeCCTACGGGNGGCWGCAG3′）和805R（5′GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC3′）。PCR反应体系包括：10×PCR buffer 5.0 μL；dNTP（10 mmol/L each） 0.5 μL；Genomic DNA 10 ng；BarPCR primer F（50 μmol/L）1.0 μL；Primer R （50 μmol/L）1.0 μL；Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL；ddH2O加至50.0 μL。

反应条件如下所示： 94 ℃、30 s；94 ℃、20 s，45 ℃、20 s，65 ℃、60 s，5个循环；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s，20个循环；72 ℃、5 min；10 ℃、∞。

PCR产物检测后，采用生工琼脂糖回收试剂盒（code： SK8131）对DNA进行纯化回收，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rRNA基因高通量测序。

1.2.3数据分析。

该研究中Roche 454 GS FLX+平台和Illumina Miseq 300PE平台测序所得的序列主要通过QIIME[9]软件来进行分析。采用QIIME中的“split_libraries.py”命令根据barcode序列对样品进行区分，并删除低质量序列：①序列长度小于200或大于1 000个碱基；②序列中存在6个及以上的模糊碱基；③测序时Q值的平均值低于25；④序列中存在的单碱基重复超过6个；⑤前端的barcode序列有1个及以上碱基的错配；⑥引物序列有1个及1个以上碱基错配。高质量序列通过uclust[10]的方法在97%相似度的水平上对所有样品进行OTU划分，并选取代表序列利用blast[11]方法与Greengenes[12]数据库比对，获得分类学信息。

2结果与分析

2.1卷烟加工过程中细菌群落的结构分析

2.1.1薄板制丝工艺中细菌群落的组成及变化。

在云烟（软珍）薄板制丝工艺各加工工序样品（RB01～09）中，共获得高质量序列95 603条，平均每个样品包含10 622条有效序列。所有序列共被注释到了包含12个已知的菌门在内的16个菌门中（图1），其中包括以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和蓝藻菌门（Cyanobacteria）为主要丰富度的微生物类群，还包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、异常球菌-栖热菌门（DeinococcusThermus）、梭杆菌门（Fusobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospira）、螺旋体门（Spirochaetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia），此外，还有3个分类地位不明确类群（OD1、OP10和TM7）以及未被分类类群（Unclassified bacteria）。在12个已知门类的微生物类群中，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和蓝藻菌门（Cyanobacteria）的平均序列量分别占到云烟（软珍）薄板制丝工艺各加工工艺所有样品细菌类群的总注释序列量的59.2%、24.9%、6.5%和8.8%。可见，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）这2个菌门在烟叶处理过程的细菌群落结构组成中为主要优势类群。对比薄板制丝工艺不同阶段的优势菌门相对丰度的变化，结果表明，随着薄板制丝工艺加工过程的不同，细菌群落的组成丰度也显著变化，变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度大体呈现先增加后减少的趋势，而厚壁菌门（Firmicutes）却呈现出先减少后增加的趋势。

2.1.2气流制丝工艺中细菌群落的组成及变化。

在云烟（软珍）气流制丝工艺各加工工序样品（RQ01～09）中，共获得高质量序列113 995条，平均每个样品包含12 666条有效序列。所有序列共被注释到了包括21个已知的菌门中（图2），主要包括优势门类：变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），以及酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、浮霉菌门（Planctomycetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、异常球菌-栖热菌门（DeinococcusThermus）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、互养菌门（Synergistetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、衣原体门（Chlamydiae）、绿菌门（Chlorobi）、纤维杆菌门（Fibrobacteres）、黏胶球形菌门（Lentisphaerae），硝化螺旋菌门（Nitrospira）、螺旋体门（Spirochaetes）和热袍菌门（Thermotogae），此外还有6个分类地位不明确类群（TM7、Bacteria_incertae_sedis、BRC1、OD1、OP10和WS3）和未被分类类群（Unclassified bacteria）。和薄板制丝工艺类似，变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）为云烟（软珍）气流制丝工艺各加工工序样品中的主要优势菌群，分别占总序列数的46.2%、32.3%、9.9%和8.4%；此外，气流制丝工艺中拟杆菌门（Bacteroidetes）占总序列量的1.1%。

2.2不同放置形式下的烟叶表面微生物结构分析

在不同城市放置不同时间下的云烟（软珍）产品（Rcontrol、RM01、RM02、RM03、RM04、RM05、RW01、RW02、RW03、RW04、RW05、RH01、RH02、RH03、RH04、RH05、RK01、RK02、RK03、RK04、RK05）在门一级水平上，所有序列共被注释到了24个门，其中包括以厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）为主的优势菌门，还包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、嗜热丝菌门（Caldiserica）、衣原体门（Chlamydiae）、绿弯菌门（Chloroflexi）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、異常球菌-栖热菌门（DeinococcusThermus）、纤维杆菌门（Fibrobacteres）、梭杆菌门（Fusobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等。此外，还有4个分类地位不明确类群（OD1、OP10、TM7和Bacteria_incertae_sedis） 和未被分类类群（Unclassified bacteria）。具体物种相对丰度如图3所示。

3结论与讨论

高通量测序技术是目前微生物多样性研究应用最为广泛高效的方法[13]。该研究采用高通量测序技术对不同制丝工艺的卷烟及其运输过程中烟叶表面微生物多样性进行研究，每个样品平均获得12 842条高质量序列，划分为21个已知门类。对不同制丝工艺及不同运输过程烟叶表面微生物群落的研究均表明，包括变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes），以及放线菌门（Actinobacteria）在内的类群为主要微生物门类。已有研究表明，发酵烟叶表面微生物多样性较为丰富，且以细菌为主，其中芽孢杆菌类群较为丰富，这与该研究所得宏基因组数据分析结果相一致。韩锦峰等[14]研究表明，叶面微生物数量会随着人工发酵和自然醇化而逐渐减少。雷丽萍等[15]对烟叶生长和晾制阶段细菌种群的动态变化进行了系统研究，发现白肋烟在晾制过程中，烟叶干燥速度和相对湿度与细菌总量的变化密切相关。该研究表明，随着加工工艺的改变和储存地域及时间的变化，烟叶表面微生物的类群和丰度不断发生变化，但主要类群的种类相对稳定。制丝工艺作为卷烟生产过程中至关重要一环，对其表面微生物群落研究表明，云烟（软珍）卷烟在薄板和制丝工艺下，各加工工序中烟叶表面细菌类群的变化具体表现为：不同的制丝工艺中优势菌群的相对丰度有明显差异，主要原因可能与原料烟叶的品质不同有关，也充分说明了烟草烟叶表面微生物的数量和种类随烟叶品种、产地、等级及加工方式的不同而存在一定差异[14-17]。在同一制丝工艺下，随着加工工序的不断进行，优势类群的相对丰度也在逐渐发生变化，这可能是不同加工工序的处理导致了外界环境因子（如温度和湿度等）的不断变化，从而影响了烟叶表面细菌的生理机能，而不同的微生物类群具有不同的生理适应性，因此产生了细菌优势类群数量和种类上的变化，也可能是外界物质进入后直接与细菌类群发生作用而影响其群落结构；不同制丝工艺的相同加工工序中优势菌群相对丰度同样具有明显差异，可能因为薄板和气流2种不同的制丝工艺的处理在影响着烟叶表面的群落结构，也可能因为原料烟叶自身所携带的细菌类群的种类和数量就不同，因此导致了这种差异的形成。尽管2种制丝工艺中微生物群落的变化没有明显趋势，但在二加入口的样品（RB05和RQ05）中，放线菌类群丰度均明显增多，这可能是由于随着松散回潮之后，微生物与外界空气接触充足，消耗烟叶中的糖类、纤维素、半纤维素、蛋白质等大分子有机物质，使得环境中的营养物质极度下降，而对环境适应能力较强的放线菌丰度显著升高。在这个过程中，蛋白质的消耗可以有效减少因蛋白质含量过多而产生的恶臭味[18]；糖类物质转化为醇类、脂类、单萜类等小分子化合物可以产生一定香气[19-23]；纤维素的减少可以有效减少烟叶的辛辣和刺激性[24]。因此，在此过程中很有可能是微生物影响烟叶品质（包括口感和气味）的重要环节。根据不同城市放置时间的烟叶表面微生物研究表明，除昆明之外，不同城市的烟叶在放置7 d后，微生物类群与对照的变化基本不大，且随着时间的变化，不同城市放置的烟叶表面主要微生物群落丰度的变化大体一直，也就是说，相对于时间因素来讲，空间地理因素可能不是影响烟叶微生物主要类群丰度变化的主要原因。烟叶品质的改变，可能随放置的时间不同而逐渐改变。

總之，该研究通过高通量测序技术解析了烟叶在不同制丝工艺加工及储存过程中微生物群落结构的变化，发现在一加出口和二加入口的过程中可能是与烟叶品质相关的重要阶段，为微生物制剂指导烟叶加工工艺提供理论借鉴。此外，研究还表明，在储存过程中，烟叶的储存时间可能是影响烟叶表面微生物群落变化的主要因素，而其所在地理位置环境对烟叶的影响不大。

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