超高效液相色谱法测定卷烟主流烟气中的7种酚类物质

许永　孔维松　王晋　黄海涛　刘欣　李雪梅　杨叶昆　向明　田丽梅　李晶

摘要[目的]采用超高效液相色谱法测定卷烟主流烟气中的7种酚类物质。[方法]卷烟主流烟气中的酚类用剑桥滤片捕集，然后用自主设计的新型样品前处理装置以1%乙酸超声提取，萃取液采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）分离，以1%乙酸（内含0.01moL/LB-CD）和70%乙腈（内含1%乙酸和0.01moL/LB-CD）为流动相进行梯度洗脱，卷烟主流烟气中的主要7种酚类物质在5.0min内可达到基线分离。[结果]采用新的样品前处理装置可以有效简化前处理步骤，提高分析效率；7种酚类物质在浓度为0.02～25.00μg/mL时具有较好的线性关系，线性相关系数>0.99900；检出限为2.5～6.5μg/L；在不同添加水平下，平均回收率为93.8%～98.5%，日内精密度和日间精密度考察均小于5%，具有较好的重复性。[结论]该方法能较好地应用于卷烟主流烟气中7种酚类物质的测定。

关键词 卷烟；主流烟气；酚类；超高效液相色谱法（UPLC）；新型前处理装置

中图分类号 0657.7⁺2；TS41⁺1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）11-0157-04

简单酚类化合物（苯酚、苯二酚、甲基苯酚等）是卷烟主流烟气中的一类重要有害成分，它们不但有较难闻的气味，很难被掩盖，对卷烟感观评吸产生不良影响，而且还对皮肤及呼吸道黏膜有强烈的刺激作用和致癌作用。该类化合物被加拿大政府列入46种有害成分名单，并被世界卫生组织（WHO）“烟草制品管制研究小组”列为建议的管制成分清单。因此准确测定卷烟主流烟气中酚类物质对于降低卷烟中的有害成分，提高卷烟的抽吸品质十分重要。

主流烟气中酚类物质的测定已有较多报道，主要有液相色谱法、气相色谱法、连续流动分析法、分光光度法等。用连续流动分析法和分光光度法只能测定酚类的总量，而采用气相色谱直接测定时峰形易拖尾，一般需要用衍生化。液相色谱法由于分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，在简单酚类化合物分析中得到了广泛应用。按照我国烟草行业标准YC/T255-2008，采用高效液相色谱法测定卷烟主流烟气中的酚，方法色谱分离时间长，每个样品需要40min以上，不能满足样品快速测定的要求。

为了寻找更简便、快速的分析方法，笔者采用超高效液相色谱法缩短了样品分析时间，并通过自主设计的样品萃取瓶，简化样品前处理流程，使样品前处理周期明显缩短。改进方法和目前常规液相色谱分析方法相比，日样品分析量明显提高。该方法的建立为卷烟主流烟气中酚类化合物的测定提供了快速、准确、可靠的高通量分析方法。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1主要材料。市售卷烟5种，购自昆明市某超市。

1.1.2主要试剂。邻甲酚、间甲酚、对甲酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚和苯酚标准品（纯度>99%，购自瑞士Fluka公司）；β-环糊精（β-CD，分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC级，购自Merk公司）；乙酸（分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司）。

无酚蒸馏水：每升水中加入1g硫酸铜，用石英亚沸蒸馏器重蒸，并用Millipore-Q50超纯水仪（美国Millipore公司）处理。

1.1.3主要仪器。SM400直线型吸烟机（英国斯茹林公司）；WatersAcQUITY超高效液相色谱系统，包括二元梯度泵，Empower色谱工作站，荧光检测器（美国waters公司）；AE240电子分析天平（精确至0.0001g，Mettler公司）；电热恒温超声波水浴锅（常州诺基仪器有限公司）；Millipore-Q50超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2方法

1.2.1样品前处理装置。试验设计的新型样品前处理装置结构见图1，装置由带密封圈的外套管（图1a）和带0.45μm过滤筛板的内套管（图1b）组成。样品提取状态为图lc，样品过滤及转移状态为图1d。

1.2.2标准溶液配制。分别准确称取50mg的7种酚类化合物于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得1.0mg/mL的7种酚类标准储备液，储备液在4℃下避光保存。使用时分别取1.0mL储备液于10mL容量瓶中，用乙腈定容，得O.1mg/mL的酚类混合标准溶液，用该混合标准溶液逐级稀释成所需浓度的标准工作液。

1.2.3色谱条件。色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；柱温30℃；柱流速0.5mL/min；进样量5.0μL；流动相A：1%的乙酸水溶液（内含0.01mol/LB-CD）；流动相B：70%的乙腈（内含1%的乙酸和0.01mol/LB-CD）；洗脱梯度：0～1.5min，10%B；>1.5～3.0min，10%～40%B；>3.0～4.5min，40%～80%B；>4.5～5.0min，80%B；>5.0～5.5min，10%B；>5.5～7.5min，10%B。

采用熒光检测器程序波长检测，检测波长（激发波长/发射波长，mm）为0～1.5min，284/332nm；>1.5～2.0min，275/315nm；>2.0～2.8min，277/319nm；>2.8～3.8min，272/309nm；>3.8～6.0min，273/323nm。采用比较标样与样品的荧光光谱色谱峰保留时间法定性，外标法定量。

1.2.4试验设计。每种卷烟样品取1条，在GB/T16447规定的条件下进行平衡，参照文献用SM400直线型吸烟机按照标准GB/T19609-2004规定的条件抽吸卷烟，每个孔道抽吸4支烟，用44mm剑桥滤片捕集卷烟主流烟气。吸烟完毕，空吸一口空气后，取出滤片。

将装置放到固定架上，并将剑桥滤片置于外套管中（图1a），用50mL移液枪在装有样品的套管中加入50mL1%的乙酸水溶液，然后把内套管卡在外套管的口部（图1c）。装好后将固定架放到恒温超声波水浴锅中超声萃取25min。萃取完后把内套管向下压，萃取溶液通过过滤筛板进入到内套管中，并从内套管中的细弯管流出，达到样品过滤的效果（图1d）。从细弯管口收集萃取液，弃去最初的2.0～3.0mL，然后用色谱进样瓶直接收集1.0～1.5mL的样品萃取液，供液相色谱分析。

2结果与分析

2.1样品前处理 试验参照YC/T255-2008的方法，每个44mm剑桥滤片抽吸4支卷烟，用50mL1%的乙酸水溶液超声萃取。试验结果表明，超声萃取20min左右7种酚类化合物可萃取完全，收集残渣再萃取1次，已经没有酚类化合物检出，延长超声萃取时间对酚类化合物的测定结果没有影响，该试验选择超声萃取25min。

为了进一步减少样品前处理环节，该研究设计了样品前处理装置（图1），该装置由带密封圈的外套管（图la）和带0.45μm过滤筛板的内套管（图1b）组成。在外套管中加入剑桥滤片（图1a），然后加入萃取溶剂（1%乙酸水溶液）。把内套管卡在外套管的口部（图1c），可防止样品萃取过程中萃取溶液溅出或超声水浴锅中的水溅入。装好后将装置放到超声波水浴锅中超声萃取，萃取完后将萃取瓶的内套管向下压，萃取溶液就通过过滤筛板进入到内套管中，并从内套管中的细弯管流出，用色谱进样瓶从细弯管口部收集流出的萃取溶液，可直接进行液相色谱分析。

整个样品前处理过程中不需要样品转移就能得到过滤好的待分析样品，前处理操作得到简化。试验操作过程中样品前处理步骤得到简化，有可能会增加引入误差的环节也会相应减少，分析结果的精密度也会提高。另外，按常规方法进行样品前处理操作，用针头过滤器过滤，超声过程中产生的剑桥滤片碎屑会堵塞过滤头，过滤速度较慢。而在改进的处理方法中，超声萃取完成后稍加放置，剑桥滤片碎屑就沉到底下，过滤时内套管中的筛板只与上层清液接触，这样可有效避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，过滤操作更容易实现。

2.2色谱条件优化 为了缩短分析时间，该试验通过超高效液相色谱分析，采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）分离7种酚类化合物，参照YC/T255--2008的流动相条件，对甲酚和问甲酚无法实现分离。根据文献报道，对甲酚、间甲酚和邻甲酚与β-环糊精（β-CD）空腔的契合程度不同，所形成的包结物稳定性不同，会导致保留时间有更大差异，可将甲酚异构体分离。该试验参照文献的方法，在流动相中添加β-CD，使邻、对、间甲酚达到分离。用1%乙酸（内含0.01mol/Lβ-CD）和70%乙腈（内含1%乙酸和0.01mol/Lβ-CD）为流动相，试验结果表明，A为1%乙酸，B为70%乙腈，按0～1.5min，10%B；>1.5～3.0min，10%～40%B；>3.0～4.5min，40%B～80%B；>4.5～5.0min，80%B；>5.0～5.5min，10%B；>5.5～7.5min，10%B梯度條件，7种酚类化合物均可达到基线分离且分离时间短，因此试验优选该流动相条件进行色谱分离。

采用荧光检测器检测，不同的酚类化合物具有不同的激发波长和发射波长，对苯二酚激发波长284nm，发射波长332nm；间苯二酚激发波长275nm，发射波长315nm；邻苯二酚激发波长277nm，发射波长319nm；苯酚激发波K272nm，发射波长309nm；对甲酚、间甲酚、邻甲酚激发波长273nm，发射波长323nm。试验参照YC/T255-2008采用程序波长检测，选择的检测波长（激发波影发射波长，nm）为0～1.5min，284/332nm；>1.5～2.0min，275/315nm；>2.0～2.8min，277/319nm；>2.8～3.8min，272/309nm；>3.8～6.0min，273/323nm。

2.3方法的线性关系和检出限 分别配制不同浓度酚类化合物的标准溶液，在选定试验条件下进行色谱进样，图2为7种酚类物质的标准色谱图。从图2可看出，各待测组分均达到了基线分离，而且色谱峰对称性好，无明显拖尾。包括回到起始梯度和平衡时间在内，整个样品色谱分析时间只需7.5min，与YC/T255-2008方法相比分离时间缩短至1/5。

根据不同浓度的峰面积，计算出回归方程，根据信噪比S/N=3计算检测限，根据信噪比S/N=10计算定量限，结果见表1。

2.4加标回收率及方法精密度 取相同卷烟2份，其中1份作为空白，另外1份加入已知量酚类物质的标样（2.5、10.0、40.0μg），另1份不加，通过加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，结果见表2。从表2可以看出，方法的回收率为93.8%～98.5%，说明方法具有很高的回收率。取3个不同卷烟样品，按选定试验条件在同一天内和不同天内分别平行测定7次，计算7次平行测定结果的相对标准偏差。结果表明7种酚类物质测定结果的日内精密度RSD为1.4%～2.5%，日间精密度RSD为1.8%～3.3%，说明方法精密度好，可以应用于主流烟气中酚类物质的检测。

2.5实际样品分析 选择不同类型的5个卷烟样品，按选定试验条件进行测定，图3为某个实际样品色谱图。实验室方法结果与烟草行业标准YC/T255-2008的分析结果比较见表3。从表3可以看出，5个样品中7种酚类化合物的分析结果均和烟草行业标准的测定结果相符合。说明该方法测定结果准确，可以应用于实际样品检测，相较于行业标准检测效率明显提高。

3结论

该研究针对目前烟草行业标准测定卷烟主流烟气中的酚类化合物分析周期长的特点，对超高效液相色谱技术在卷烟烟气酚类化合物分析中的应用进行了研究。研究通过自主设计的样品前处理装置，明显简化了样品前处理操作，使样品前处理周期有效缩短，改进方法和目前行业标准相比，日样品分析量可提高5倍以上；色谱分离方面，实现了烟草中的7种酚类物质在5min内完全分离，提高了样品分析效率。该方法的建立为卷烟主流烟气中酚类化合物的测定提供了快速、准确、可靠的高通量分析方法。