松花肽的体内体外抗氧化活性研究

尹利端 石丽花 王长伟 鞠东 李八方 刘楚怡

摘要 [目的]评价不同分子量松花肽的体内和体外抗氧化能力。[方法]通过体外抗氧化试验和老龄小鼠体内抗氧化试验综合评价不同平均分子量松花肽的抗氧化能力。体外部分，研究了9种松花肽的超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基清除能力；体内部分，采用老龄Balb/c种小鼠，研究体外试验中效果最好的2种松花肽对小鼠体内丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力和谷光甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的影响。[结果]发现平均分子量为1 565和561 Da的松花肽具有更好的超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基的清除能力，并能够显著增加老龄小鼠的SOD活力和GSH-Px活力，显著降低MDA的含量。[结论]2种松花肽均具有显著的抗氧化活性。

关键词 松花肽；分子量；动物试验；抗氧化活性

中图分类号 TS201.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）31-0163-04

Abstract [Objective]To evaluate the in vivo and in vitro antioxidant capacity of different molecular weight pine pollen peptides.[Method]The antioxidant capacity of different average molecular weight of pine pollen peptides were evaluated synthetically by in vitro antioxidant experiments in aged mice.In vitro experiments were conducted on the inhibition of superoxide anion free radicals，hydroxyl radical inhibition，and DPPH scavenging activity of 9 pine pollen peptides.In vivo，Balb/c mice were used to study the effects of peptides on the activities of TSOD and GSHPx，and contents of MDA in aged mice.[Result]It was found that pine pollen peptides with an average molecular weight of 1 565 and 561 Da had better scavenging abilities of superoxide anion radicals，hydroxyl radicals and DPPH radicals，and could significantly increase TSOD and GSHPx activity，and significantly reduced the content of MDA in aged mice.[Conclusion]It was demonstrated that 1 kD and 13 kD pine pollen peptides have significant antioxidant activity.

Key words Pine pollen peptide；Molecular weight；Animal experiment；Antioxidant activity

人类的机体衰老机制和疾病产生机理长久以来都是国内外学者们致力解决的重大科学问题[1-2]。近年来，随着Harman自由基理论的提出，人们对人体内氧化产生的自由基的认识逐渐深入，发现人的衰老和多种疾病的发生都与自由基的过量产生相关[3]。探索安全高效的消除自由基的方法逐渐成为了当前学者们研究的热点[4]。抗氧化剂是近年来发展较快的一类能够消除自由基的物质，既包括化学合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）等，也包括大豆多肽等抗氧化活性多肽[5]。与化学合成的抗氧化剂相比，抗氧化多肽具有安全、高效等特点，能够更广泛地作为基料或功能因子应用于保健食品及化妆品等功能制品的开发。

松花粉是指经人工采集得到的马尾松（Pinus Massoniana）等松树的干燥花粉[6]。松花粉作为生命的遗传物质，含有丰富的蛋白质、微量元素、黄酮及必需脂肪酸等营养成分及生物活性物质，具有延缓衰老、抗氧化、抗疲劳、促进生长发育、调整机体代谢等多种功效[7]。若能够通过安全有效的处理方法提取制备松花肽，不仅能够更充分开发松花粉中大量优质的蛋白质资源，也能有效增加松花粉中营养成分的利用率[8]。因此，开发具有清除自由基作用的抗氧化松花肽具有重要的理论意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 松花分离蛋白，山东烟台新时代健康产业有限公司；超氧阴离子自由基检测试剂盒、羟自由基检测试剂盒、DPPH自由基试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活力檢测试剂盒、谷光甘肽过氧化物酶（GSH-px）活力检测试剂盒及丙二醛（MDA）含量检测试剂盒，南宁建成生物工程有限公司；胰酶，南宁庞博生物工程有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、三氯乙酸、硫化钠等常用试剂均为分析纯。Agilent 1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；UV-2010PC紫外分光光度计，尤尼克（上海）仪器有限公司；荧光显微镜，Olympus公司；SPF级Balb/c小鼠，山东朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同分子量松花肽的制备。

将松花分离蛋白加水配制成40 mg/mL的松花蛋白溶液，加入3 400 U/g胰酶，在pH 9，50 ℃的条件下分别酶解15、30、60、90、120、150、180、210和240 min后，100 ℃水浴中终止反应，并通过高效液相色谱法（HPLC）验证其平均分子量。

1.2.2 分子量分布的测定。

使用TSK GEL G3000PWXL色谱柱，通过高效液相色谱测定9种松花肽的分子量分布。检测条件：以体积比1∶1的乙腈与0.2%三氟乙酸（TFA）混合溶液为流动相，按0.5 mL/min的流速过柱，紫外检测波长为225 nm。取牛血清蛋白、VB12、谷胱甘肽及胶原蛋白样品各1 mg，分别溶于1 mL的纯水中，用0.45 nm微孔滤膜过滤后进样。HPLC结果通过GPC软件进行分子量分布和平均分子量的分析。

1.2.3 超氧阴离子自由基清除率的测定。

松花肽清除超氧阴离子自由基的能力采用邻苯三酚自氧化法测定。邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化，生成有色中间产物和超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基对自氧化有催化作用。选择超氧阴离子自由基试剂盒进行检测，以蒸馏水代替样品做空白组，按下式计算清除率。

超氧阴离子自由基清除率=（A空白-A样品）A空白×100%

式中，A样品、A空白分别为样品和空白的吸光值。

1.2.4 DPPH自由基清除率的测定。

松花肽对DPPH 自由基的清除能力采用酶标仪法测定，选择南京建成的DPPH 自由基检测试剂盒进行检测，在517 nm 波长下测定。按下式计算清除率。

DPPH自由基清除率=1-Ap-AcAmax×100%

式中，Ap为样品和 1 mmol/mL DPPH 自由基反应后的吸光值；Ac为不加 DPPH 自由基时样品的吸光值；Amax为加 DPPH 自由基但不加样品 （以80% 甲醇代替样品） 的吸光值。

1.2.5 羟自由基清除率的体外测定。

松花肽样品的羟自由基清除能力采用羟自由基检测试剂盒进行检测，在波长 520 nm 处测定吸收度。 空白组以蒸馏水代替供试样品，并按下式计算清除率。

羟自由基清除率=（A样品-A空白）（A对照-A空白）×100%

式中，A样品、A空白、A对照分别为样品、空白和对照的吸光值。

1.2.6 动物分组与计量选择。

选用SPF级，8～12个月的老龄Balb/c小鼠进行试验。在1～3 kD 和< 1 kD 2个区间内分别选择一种体外抗氧化效果较好的松花肽，各设3个剂量组，试验样品的推荐用量为每人每日 6.0 g，每人按60 kg 体重计，相当于 0.1 g/（d·kgBW），按人体推荐量的 5、10、20 倍确定小鼠的低、中、高剂量，即各组小鼠每日剂量分别为0.5、1.0、2.0 g/kgBW。按照《保健食品评价与检验技术规范》[9]中的试验方法进行试验，以人体食用推荐量的10倍为中剂量组；另设2个剂量组分别为人体推荐剂量的5倍和20倍；另有一个空白对照组，以大豆肽为阳性对照组，将该试验老龄小鼠分成8组，每组10只，分别连续灌胃对应样品30 d后，眼球取血，分离得到血清，用于后续血清中抗氧化酶活力及脂质氧化的检测。

1.2.7 小鼠血清MDA含量的测定。

各组老龄小鼠连续灌胃对应样品30 d后，眼球取血，分离得到血清，通过测定血清中MDA的含量分析2种松花肽对老龄Balb/c小鼠体内MDA含量的影响。MDA是通过MDA检测试剂盒进行检测，分别设定空白管、标准管、测定管和对照管，在波长532 nm 处测定各组吸光值，平行 3 次，并按下式计算MDA含量。

MDA含量（nmol/mL）=测定OD值-对照OD值标准OD值-空白OD值×标准品（10 nmol/mL）×样品稀释倍数

1.2.8 小鼠血清的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的测定。

各组老龄小鼠连续灌胃对应样品30 d后，取肝脏组织匀浆后，测定各组小鼠肝脏T-SOD活力，分析2种松花肽对Balb/c小鼠体内SOD活力的影响。T-SOD的测定是通过T-SOD活力检测试剂盒进行，分别设定测定管和对照管，在波长550 nm 处测定吸光值，平行做3 次取平均值，按下式计算T-SOD活力。

T-SOD活力（U/mL）=对照OD值-测定OD值对照OD值÷50%×体系稀释倍数×样品稀释倍数

1.2.9 小鼠血清GSH-Px活力的检验。

测定各组小鼠血清中GSH-Px活力，分析2种松花肽对Balb/c小鼠体内GSH-Px活力的影响。GSH-Px的测定是通过GSH-Px活力检测试剂盒进行，分别设定空白管、标准管、非酶管和酶管，在波长412 nm 处测定各组吸光值，平行做 3 次取平均值，并按下式计算GSH-Px活力。

GSH-Px活力=非酶管OD值-酶管OD值标准管OD值-空白管OD值×标准品（20 nmol/mL）×稀释倍数

1.3 数据统计 采用Origin 8.0作图，SPSS软件进行试验数据统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 松花肽的分子量分布

首先通過HPLC和GPC软件分析了不同酶水解时间9种松花肽的平均分子量和相对分子质量分布，结果如表1所示。9种松花肽的平均分子量在561～2 100 Da，并且随着酶解时间的增加，松花肽的平均分子量逐渐减小，较大分子量（>5 kD）的肽段含量逐渐降低，而短肽（<0.3 kD）的比例逐渐增加。

2.2 松花肽的体外抗氧化活性

通过体外抗氧化试验分析9种不同分子量松花肽的超氧阴离子自由基清除率，结果如图1所示。当松花肽浓度为5 mg/ mL时，9种松花肽的超氧阴离子自由基清除能力均显著高于松花蛋白（P<0.05）。且随着酶解时间的增加，得到松花肽的超氧阴离子自由基清除能力先增加后降低，酶解90 min时得到的松花肽具有最强的清除超氧阴离子自由基的能力。即酶解90 min，平均分子量为1 561 Da的松花肽超氧阴离子自由基清除率为34.8%。

9种松花肽对DPPH自由基清除能力的结果如图2所示。当松花肽浓度为5 mg/ mL时，随着酶解时间的增加，得到的松花肽清除DPPH自由基的能力逐渐增加，酶解240 min时得到的松花肽DPPH清除率最高。除酶解15 min的松花肽外，8种松花肽的DPPH自由基清除率均显著高于松花蛋白（P<0.05），其中酶解90和240 min得到的松花肽的DPPH自由基清除能力最高，分别为75.6%和77.8%。

图3显示了9种松花肽的羟自由基清除能力。当控制各松花肽浓度为5 mg/ mL时，与未酶解的松花蛋白相比，9种松花肽的羟自由基清除率均显著增高（P<0.05）。且随着酶解时间的增加，得到的松花肽抑制羟自由基的能力逐渐增加，酶解240 min时得到的松花肽的羟自由基清除率最高，为86.8%。

综合分析以上9种不同分子量松花肽的体外抗氧化能力，选择超氧阴离子自由基和DPPH自由基清除能力最高的酶解90 min松花肽（1 565 Da）和羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力最高的酶解240 min松花肽（561 Da）作为1～3 kD 和< 1 kD 2个分子量区间松花肽的代表，进行后续动物试验。

2.3 松花肽对老龄小鼠脂质过氧化的影响

该研究选择体外抗氧化试验中筛选出的1～3 kD 和< 1 kD 2种分子量的松花肽，使用老龄小鼠，连续灌胃30 d后，眼球取血，测血中MDA含量变化，分析松花肽对小鼠体内MDA含量的影响，结果如图4所示。与阴性对照相比，<1 kD松花肽低、中剂量组，1～3 kD松花肽中、高剂量组的MDA含量极显著降低（P<0.05），说明2种松花肽具有抗脂质氧化活性。

2.4 松花肽对老龄小鼠SOD活力的影响

SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。图5显示了2种分子量的松花肽对老龄小鼠肝脏中T-SOD活力的影响。与阴性对照相比，除<1 kD松花肽高剂量组的SOD酶活力显著升高（P<0.5）外，其他试验组以及大豆肽的SOD酶活力均极显著增加（P<0.05），说明阳性对照和2个分子量松花肽均具有SOD抗氧化活性。

2.5 松花肽对老龄小鼠GSH-Px活力的影响

一般认为，GSH-Px是一种可以在细胞内清除有害过氧化物代谢产物的酶，能够阻断脂质过氧化的连锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。因此，分析了2种分子量的松花肽对老龄小鼠血清中GSH-Px活力的影响，结果如图6所示。与阴性对照相比，<1 kD松花肽和1～3 kD松花肽的3个剂量组以及阳性对照的GSH-Px活力均极显著增加（P<0.05）。

综合老龄小鼠体内抗氧化试验结果可得，2种分子量的松花肽均具有体内抗氧化活性。因此，松花肽可作为一种天然抗氧化剂及抗氧化活性成分，被应用于功能食品及保健品的研究与开发中。

3 结论

该研究对松花肽的抗氧化性进行了体内和体外的研究。体外部分，研究了9种不同分子量松花肽的体外抗氧化能力，发现添加量为5 mg/mL 时，平均分子量1 565 D松花肽的超氧阴离子自由基清除能力最高（34.8%），而561 D松花肽的羟自由基清除能力（86.8%）和DPPH自由基清除能力（77.8%）最高。体内部分，研究了以上体外试验中效果最好的2种松花肽对小鼠体内MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力的影响，发现这2种松花肽均能够显著增加T-SOD活力和GSH-Px活力，并降低MDA的含量，满足《保健食品评价与检验技术规范》中抗氧化功能的判定要求。综上所述，2种松花肽均具有显著的抗氧化活性。

参考文献

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