2016—2017年我国部分地区白斑综合征病毒wsv006的变异分析
2018-05-14蔡苗刘庆慧万晓媛黄倢
蔡苗 刘庆慧 万晓媛 黄倢
摘要 [目的]了解wsv006蛋白结构变异情况,并进一步为其蛋白功能研究提供参考资料。[方法]以2016和2017年在全国18个地区采集的WSSV阳性样品为模板,采用PCR方法,用特异性引物扩增wsv006基因,经连接转化后进行测序,并对测序结果进行分析。[结果]在2016年的47 份样本中有9个样本,包括河北黄骅、山东日照、河北沧州和河北唐山4个地区的样本中出现了wsv006目的条带,检出率为19%。在2017年的39 份 WSSV 阳性样本中有16个样本,包括福建霞美镇、河北黄骅、广东湛江、山东滨州、山东东营和上海6个地区的样本中出现了wsv006的目的条带,检出率为41%。氨基酸序列比对结果显示,扩增的wsv006编码氨基酸变异包括氨基酸替换、插入、缺失和提前终止翻译,其中插入的主要是脯氨酸(P)和苏氨酸(T),插入位点在第151~166位,处于PT的交叉重复区域;终止翻译是由于核苷酸第541位插入了GAGG,在转录过程中形成了终止密码子。[结论]wsv006氨基酸序列存在明显变异。
关键词 WSSV;wsv006;变异
中图分类号 S945.4文献标识码 A文章编号 0517-6611(2018)33-0075-05
对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一类无包涵体的具囊膜、 一端有尾巴状结构、杆状的双链环状 DNA病毒[1],大小约为300 kb。1992年,WSSV最早在我国台湾等地的对虾养殖区暴发,而后在亚洲各国对虾养殖区相继暴发,给全世界各地的对虾养殖业带来了巨大的经济损失[2],从而引起全球对虾养殖业者的广泛关注。1995年,世界动物卫生组织(OIE)及亚太水产业养殖中心(NACA)将WSSV列为需要通告的重要水生动物疾病病原[3]。2001年,中国和荷兰科学家分别报道了该病毒的全基因组DNA序列,启动了WSSV后基因组研究[4]。2005年,国际病毒分类委员会第7次报告提出把WSSV归入到线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus),它是此新科中唯一的成员[5]。2009年,该病毒被农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》列为水生生物一类动物疫病病毒[6]。WSSV感染的宿主范围很广,它不仅侵染各种野生及养殖对虾,而且侵染其他水生甲壳类,如蟹类、螯虾和龙虾等,已成为对水生甲壳类危害最大、传染最广泛的病毒,特别是对对虾种群影响最严重,至今已报道有40多种节肢动物可感染或携带WSSV[6-8]。
迄今为止,GenBank上共公布了7个WSSV基因全序列,研究最多的分别有中国大陆株(WSV-CN)[9]、中国台湾株(WSSV-TW)[10]和泰国株(WSSV-TH)[11]。MARKS等[12]通过基因组全序列比对归纳出这3个毒株的基因组之间序列有约99%的核苷酸保持一致性,存在的主要差异是:①大片段序列插入/缺失;②易于发生基因重组的变异区;③开放性阅读框(open reading frames,ORFs)内出现的重复单元变化差异(variable number tandem repeat,VNTR)[9,11];④转座酶基因序列存在与否;⑤单核苷酸的缺失、插入及多态性(singlenucleotide polymorphisms,SNPs)。目前应用于WSSV流行病学研究的主要有ORF14/15和ORF23/24的缺失变化,ORF75、ORF94和ORF125的VNTR 数目以及单核苷酸多态性[13],而对于WSSV其他基因的变异情况及其在WSSV流行病学研究中的作用尚未有深入的研究。wsv006基因全长885 bp,编码295个氨基酸,有关其在不同地理样本中的变异情况尚不清楚。该研究通过对2016和2017年我国18个地区WSSV病害暴发区采集的86份WSSV阳性样本进行wsv006基因的 PCR 扩增、克隆和测序,分析wsv006蛋白结构变异,为WSSV分子流行病学研究提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 样本来源 取2016和2017年1—7月在全國18个地区WSSV病害暴发区采集的患病样本,样本采集信息及各个样本对应的wsv006扩增结果见表1、2。所有样品采集后当天冷藏运输至实验室后冷冻保存在-20 ℃冰箱。
1.2 主要试剂和引物
海洋动物组织基因组 DNA 提取试剂盒(离心柱型) 购自擎科生物技术(青岛)有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA Marker均购自宝生物工程(大连) 有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒购自索莱宝生物科技(北京)有限公司;pMD18-T克隆载体、感受态细胞TOP10均购自青岛秀佰锐生物器材有限公司;LB培养基、氨苄青霉素购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.3 病毒核酸提取 取约30 mg鳃组织,进行DNA提取,提取产物置于-20 ℃冰箱备用。
1.4 样本的套式PCR检测 将DNA样本按照《白斑综合征(WSD)诊断规程GB/T 28630.2—2012》第2部分套式PCR 检测法进行WSSV检测,而后通过1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.5 wsv006基因的PCR扩增
将“1.3”中检测呈WSSV 阳性的样本进行 wsv006基因扩增。采用25 μL的体系:10× PCR 反应缓冲液(含 Mg2+) 2.5 μL、双蒸水17.3 μL、dNTP 2 μL、正向引物(5-ATGAAGAATTCGCGGCAGAG-3)与反向引物(5- GGAAGATCTGAAGGAACTG-3)各1 μL,Ex Taq DNA 聚合酶 0.2 μL,WSSV 模板1 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s,扩增35个循环;72 ℃延伸7 min。
46卷33期 蔡 苗等 2016—2017年我国部分地区白斑综合征病毒wsv006的变异分析
1.6 wsv006基因的克隆及序列分析
将“1.5”中的阳性 PCR 产物经回收純化后与载体 pMD18-T 连接,转化至TOP10感受态细胞中,在LB液体培养基中37 ℃振荡培养1 h复苏抗性,然后在添加氨苄青霉素的平板培养基上涂布,37 ℃过夜培养,每个平板挑取至少5个单菌落接种于添加氨苄青霉素的 LB液体培养基中 37 ℃ 振荡4 h,取培养物为模板,按“1.5”方法进行鉴定,将PCR鉴定为阳性的菌液全部送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA双向测序。测序结果采用DNAMAN8软件进行序列比对分析,用ORF Finder处理测序结果,得到编码的氨基酸序列,然后再用DNAMAN8软件分析,以中国株wsv006氨基酸序列作为参照(AF332093),得出氨基酸水平上的变异情况。
2 结果与分析
2.1 套式 PCR 检测结果
2016年的47份样本中,共有33份样本在第1轮扩增中呈现WSSV阳性,其余14份样本均在第2轮扩增中呈现阳性。而2017年的39份样本中共有9份样本在第1轮扩增中呈现WSSV阳性,其余30份样本均在第2轮扩增中呈现阳性。
2.2 wsv006基因的克隆
2016年的47份样本中,PCR 扩增只在河北黄骅、山东日照、河北沧州和河北唐山4个地区的样本中出现了wsv006目的条带,共有9个样本,检出率为19%,分别是HH-6、SR-13、SR-15、HC-19、HT-34、HT-35、HT-36、HT-40、HT-41;其余38个样本均未扩增出该基因片段。 在2017年的44 份WSSV阳性样本中,PCR扩增只在福建霞美镇、河北黄骅、广东湛江、山东滨州、山东东营和上海6个地区的样本中出现了wsv006目的条带,共有16个样本,检出率为41%,分别是FX-7、FX-8、FX-9、FX-10、FX-11、FX-13、FX-14、HH-15、HH-16、HH-17、GZ-28、GZ-29、GZ-30、ZT-36、SB-37、SH-39,其余23个样本均未扩增出该基因片段。
2.3 序列比对 在扩增出wsv006的25个样本中,除2017年河北黄骅的3个样本氨基酸未发生变异外,其余22个样本的wsv006编码氨基酸变异明显。氨基酸的变异类型为单个氨基酸替换与缺失、多个氨基酸插入和终止翻译(表3、4)。在不同年份和地区的样本中插入位点、插入序列数目和排列顺序存在差异,插入的主要是脯氨酸(P)和苏氨酸(T),插入位点处于这2种氨基酸的交叉重复区域,该区域存在2个PTPTPTPP重复单元,经过DNAMAN比对结果显示插入位点有3个,即第1个单元之前、2个单元之间和第2个单元之后,由于插入序列为PT循环或PT循环与PP交叉,这与重复单元序列极为相似,因此不能确定具体的插入位点,仅能确定在第151~166位。除去提前终止和未变异的样本,由于插入氨基酸导致wsv006肽链的长度由原来295 aa分别变为301、303、305和307 aa,其中301 aa长度出现在2016年河北唐山和2017年山东滨州的样本中,插入序列为PTPTPT(图1);303 aa长度出现在2016年河北黄骅和2017年广东湛江的3个样本中,插入序列为PTPTPTPT(图2);305 aa长度在2016年河北唐山和2017年福建霞美镇、上海的样本中出现,共7个样本,插入序列为PTPTPTPTPT;福建霞美镇的FX-8样本长度为307 aa,插入序列为PTPTPTPTPTPT(图3)。2016年山东日照和河北沧州、唐山的样本以及2017年山东东营的样本中都出现了在第184位提前终止翻译的现象(图4),这主要是由于核苷酸序列的第541位插入了GAGG,导致了移码突变,在转录过程中第543~545位形成了终止密码子UGA。除去终止翻译的样本,其余的16个样本均在第172位出现氨基酸的替换,T→I。
3 讨论
2016年的样本中,同一地区的样本变异情况存在差异性,如河北黄骅的样本中,其wsv006基因编码长度包含301、305 aa,并出现提前终止翻译的现象。不同地区的变异情况也存在相似性,河北黄骅的HH-06和河北唐山的HT34、HT35和HT40变异情况相似,其中HT34和HT40的序列完全相同。山东日照的SR-13和SR-15,河北沧州的HC-19和河北唐山的HT-36和HT-41出现的变异类型一致,并且都在第184位终止翻译,其中SR-13、HC-19、HT-36和HT-41序列完全相同。2017年的样本中,同一地区样本变异情况的一致性主要体现在河北黄骅和广东湛江的样本中;而福建霞美镇的样本除FX-07以外,其他6个样本序列完全相同,在表现出差异性的同时又保持了一致性。山东东营SD-38出现3种变异类型,即替换、插入和缺失,并且它还是2017年样本中唯一出现提前终止的样本。
将这些样本经过motify scan软件分析后发现,这些变异位点并不在其功能域内。插入序列主要是脯氨酸(P)和苏氨酸(T),脯氨酸能够增强植物的抗性,有研究表明,植株染病毒的番茄花药发育过程中游离脯氨酸积累开始较晚,任一花药发育时期花药中的游离脯氨酸含量均低于同一发育时期的健康植株,花粉萌发率也低[14]。植物在环境胁迫条件下,脯氨酸对植物的生理代谢有很大影响[15]。苏氨酸的结构中含有羟基,对人体皮肤具有持水作用,与寡糖链结合,对保护细胞膜起重要作用,在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。目前,德国科学家在人体血液中发现了一种苏氨酸,试验发现它可以阻止艾滋病病毒附着和侵入体细胞,通过干扰艾滋病病毒的表面蛋白,使其不能发挥作用。因此,wsv006功能以及氨基酸变异对其功能的影响需要深入研究。
参考文献
[1] WONGTEERASUPAYA C,VICKERS J E,SRIUAIRATANA S,et al.A nonoccluded,systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon[J].Dis Aquat Org,1995,21(1):69-77.
[2] 蔡生力,黃倢,王崇明,等.1993─1994年对虾暴发病的流行病学研究[J].水产学报,1995,29(2):112-119.
[3] SNCHEZPAZ A.White spot syndrome virus:An overview on an emergent concern[J].Vet Res,2010,41(6):1-34.
[4] 朱建中,陆承平.对虾白斑综合征病毒研究概况[J].动物医学进展,2003,24(1):47-49.
[5] MAYO M A.A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J].Arch Virol,2002,147(8):1655-1663.
[6] 童桂香,黎小正,韦信贤,等.白斑综合征病毒广西株缺失区基因的比较分析[J].上海海洋大学学报,2014,23(1):8-14.
[7] 姚泊,何建国,莫福.白斑综合症杆状病毒对对虾和罗氏沼虾致病性的研究[J].广州大学学报(自然科学版),2002,1(1):35-38.
[8] WANG B,LI F H,DONG B,et al.Discovery of the genes in response to white spot syndrome virus(WSSV)infection in Fenneropenaeus chinensis through cDNA microarray[J].Marine biotechnol,2006,8(5):491-500.
[9] YANG F,HE J,LIN X H,et al.Complete genome sequence of the shrimp white spot bacilliform virus[J].Journal of virology,2001,75(23):11811-11820.
[10] TSAI M F,YU H T,TZENG H F,et al.Identification and characterization of a shrimp white spot syndrome virus gene that encodes a novel chimeric polypeptide of cellular type thymidine kinase and thymidylate kinase[J].Virology,2000,277(1):100-113.
[11] VAN HULTEN M C,WITTEVELDT J,PETERS S,et al.The white spot syndrome virus DNA genome sequence[J].Virology,2001,286(1):7-22.
[12] MARKS H,GOLDBACH R W,VLAK J M,et al.Genetic variation among isolates of white spot syndrome virus[J].Arch Virol,2004,149(4):673-697.
[13] 童桂香,黎小正,韦信贤,等.白斑综合征病毒广西株缺失区基因的比较分析[J].上海海洋大学学报,2014,23(1):8-14.
[14] 王少先,林晓民,刘保国.感染病毒的番茄花药发育过程中游离脯氨酸含量与花粉萌发率的变化(简报)[J].植物生理学通讯,1999,35(3):191-192.
[15] 朱虹,祖元刚,王文杰,等.逆境胁迫条件下脯氨酸对植物生长的影响[J].东北林业大学学报,2009,37(4):86-89.