PCR技术应用举例及发展前景

俞璐云

[摘 要]聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）提出至今已有20年时间，期间PCR已发展成为分子生物学领域的一项关键技术和常规技术，极大地推动了生命科学各个领域的发展。本文简单介绍了PCR技术原理、反应过程并举例了两个具体实验中的PCR技术应用，最后简单介绍现今运用广泛的发展后的一些PCR技术，如荧光定量PCR技术等。

[关键词]聚合酶链式反应；荧光定量PCR技术；PCR技术发展

[中图分类号]F274 [文献标识码]A

1 PCR技术简介

聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction，PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

它與分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的大主流技术。这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片段扩增数百万倍，给生命科学领城的研究手段中带来了革命性的变化。由于PCR 技术的实用性和极强的生命力，PCR 技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。

2 具体实验实例

2.1 PCR技术测定不同山核桃品种特定基因的实验

核桃价格历来都比较昂贵，可利用PCR技术研究高产高品质核桃品种基因从而在种植上挑选特定品种提高经济效益。

2.1.1 前期准备

2.1.1.1 引物 每组引物都有相应上游引物和下游引物

2.1.1.2 其他材料 200ul枪头，10ul、50ul移液枪，50ul移液排枪 96孔板，擎科 PCR MIX

2.1.1.3 设备 PCR扩增仪，电泳仪，拍照仪

2.1.1.4 DNA模板样品（来源于不同地区山核桃树的芽、树枝或树叶）

2.1.2 实验过程

2.1.2.1 反应体系

Taq pcr主要混合物、前后引物再加上DNA模板，最后用无菌水定容，反应体系共为15.0ul。

2.1.2.2 扩增程序设定

PCR扩增仪盖105℃预热，设定合适的定性温度和时间、退火温度与时间设定，还有延伸温度和时间并确定合适延伸循环数。

为了防止实验人员离开而扩增结束后温度回升所带来的不利后果，可再加上4℃保温一段时间。

2.1.2.3 凝胶电泳

1.5%琼脂糖配成凝胶90ml，EB染料8ul，样品装量5ul，DNA marker（DL2000 DNA marker）5ul，电压150V，电流150A，时间20min

2.1.2.4 结果分析（紫外光拍照）

电泳结果图片对比标准的DNA maker条带长度就能知道电泳结果中，特异性条带的长度，从而也可与实际引物理论长度作对比分析，PCR扩增后显示的特异性可用作原始DNA模板的筛选和基因鉴定。批量的测定不同引物序列在这些不同的山核桃DNA模板的扩增结果，最后汇总可筛选出高产量和质量的山核桃树种，当然这需要大量的实验数据，本文只讲述其中一次的实验结果。

2.2 乳杆菌突变菌柱中H+-ATPase的调控机制实验PCR应用

2.2.1 乳酸杆菌和H+-ATPase概述

乳酸菌是发酵糖类主要产生乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称。H+-ATPase是一种细胞膜蛋白，广泛存在于乳酸菌体内，它对乳酸菌的代谢和产酸具有重要影响。

H+-ATPase的主要功能是催化ATP的合成与水解，但在不同的生物中其功能有不同的体现。在含有呼吸链的真核生物中，通常是利用呼吸链途径来合成ATP，同时又能水解ATP。但乳酸菌是原核生物，主要通过底物磷酸化途径来合成ATP，所以对于乳酸菌而言，H+-ATPase只能水解ATP而不能合成ATP，同时，通过水解ATP释放的能量来把胞内H+运出胞外，维持H+梯度。

2.2.2 PCR技术应用的重要性

PCR技术常用于基因检测序列，而在该实验中突变菌基因序列的对比，乳杆菌调控H+-ATPase编码基因检测是实验中必不可少的一部分，PCR技术的应用极大地方便了实验中基因的测序，并且结合凝胶电泳紫外观察电泳结果，更能清晰快速找出基因序列，为实验找到调控机制基因提供便利。

通过实时荧光定量 PCR 分析了亲本菌以及两种突变菌（TB-1、TB-2）的基因表达水平，同时对两株突变菌的测序结果分析，分析酶活力下降的原因与基因突变的联系。利用二环己基碳二亚胺（DCCD）和2，4-二硝基苯酚（DNP）两种抑制剂对乳酸菌细胞膜上的H+-ATPase的抑制作用进行实验，分析乳酸菌的两种不同突变菌种在代谢过程中的各类代谢物的含量差异，比较两种突变菌中H+-ATPase的活性，进而更加准确地分析H+-ATPase在乳酸菌代谢过程中的调控机制。

3 发展后的一些PCR技术

3.1 定量PCR技术

3.1.1 荧光定量PCR技术研究现状

在PCR对扩增产物定性鉴别的基础上，几年前又发展起来对模板DNA片段进行定量研究的方法，即定量 PCR（Quantitative PCR，Q-PCR）。目前应用最多的为荧光定量 PCR（FQ-PCR），它是利用Taq酶的5' 3'外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针，经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。

实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。它的特点是：（1）用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。（2）荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。（3）进行实时動态连续的荧光监测，消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。与传统的PCR相比，实时定量PCR更加快速、灵敏，并能有效地减少实验过程中产生污染的危险。

3.1.2 发展趋势

定量PCR技术具有以下的发展趋势：定量水平从粗略定量、半定量到精确定量、绝对定量；定量过程中参照物的选择从单纯外参照非竞争性定量到多种参照定量；检测手段从扩增样本终点一次检测到扩增过程中动态连续检测进行定量；检测方法由手工检测、半自动检测发展到成套设备检测， 且检测效率及自动化程度越来越高。

定量 PCR 技术在家蚕分子生物学研究中也起着相当重要的作用。常规 PCR法已广泛用于家蚕基因的克隆与研究中 ，但是仅仅在定性方面检测基因中核酸序列是否存在 ， 这是不够的，还必须从量上确定标本中的核酸 。

3.2 数字PCR技术

3.2.1 数字PCR技术简介

数字 PCR 是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。与传统定量 PCR技术不同的是数字PCR 不依赖于扩增曲线的循环阈值（CT）进行定量，受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。

数字 PCR（也可称单分子 PCR） 一般包括两部分内容，即 PCR 扩增和荧光信号分析。在 PCR 扩增阶段，与传统技术不同，数字 PCR 一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于 qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字 PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

3.2.2 数字PCR技术应用

近年来随着人类对癌症的不断研究和认识，大量证据表明癌症是一种基因（染色体）异常变化引起的疾病，普遍认可的异常情况包括癌基因及抑癌基因的突变、插入或缺失等。不过，癌细胞通常与大量正常细胞同时存在，因此，如何从大量正常细胞的DNA 中检测到少量的异常基因成为癌症研究领域关注的焦点问题之一。Vogelstein及其同事以KRAS基因突变为研究对象，对肠癌患者的粪便样品进行了数字 PCR 分析，得到KRAS基因第12号密码子点突变率约为4%。

另外数字PCR技术还常用于肿瘤早期研究和产前诊断，这都为人类的健康发展提供了许多便利。

[参考文献]

[1] 林彩琴，姚波.数字PCR技术进展[J].化学进展，2012（12）.

[2] 王伟杰.实时PCR技术及其在果树研究中的应用[A].中国园艺学会.中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C].中国园艺学会，2006.