苗药夜寒苏中异姜花素D的提取及含量测定

蒋太白 林思 周曦曦�┩踅�喜

摘要 [目的]建立HPLC测定苗药夜寒苏中异姜花素D含量的方法，并考察其提取方法。[方法]采用Waters symmetry shieldTM RP 18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以乙腈-水溶液为流动相进行梯度洗脱；流速0.5 mL/min；检测波长233 nm。[结果]异姜花素D的分离度良好，在2.046～204.600 μg/mL（r=0.999 8）呈良好的线性关系，平均回收率为96.55%（RSD=1.9）。[结论]该研究所建立的方法简单、稳定性和重复性好，可用于黄姜花中异姜花素D的快速检测。

关键词 夜寒苏；异姜花素D；提取；含量测定

中图分类号 R284 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）27-0183-03

Extraction and Determination of Isoflavone D in Rhizoma hedychii

JIANG Taibai1，LIN Si2，ZHOU Xixi1 et al

（1.Institute of Traditional Medicine of Qiandongnan Miao and Dong Autonomous Prefecture，Kaili，Guizhou 556000；2.Department of Pharmacy，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550002）

Abstract [Objective] The research aimed to establish a HPLC method for the determination of isochelon D in Rhizoma hedychii，and to investigate its extraction method.[Method]Chromatagraphic experiments were carried out on a Waters symmetry shieldTM RP 18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm），gradient elution was carried out with acetonitrilewater solution as mobile phase；the flow rate was 0.5 mL/min；the detection wavelength was 233 nm.[Result]The separation of isochelon D was good，and it showed a good linear relationship at 2.046～204.600 μg/mL （r=0.999 8），and the average recovery was 96.55% （RSD=1.9）.[Conclusion]The method is simple，repeatable and stable，which could be used for quality control of isocoronarin D from Rhizoma hedychii.

Key words Rhizoma hedychii；Isocoronarin D；Extraction；Content determination

基金项目 贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究项目（QZYY2015090）。

作者简介 蒋太白（1989—），男，苗族，贵州凯里人，执业中药师，硕士，从事民族医学研究。*通讯作者，主管中药师，硕士，从事民族医药研究。

收稿日期 2018-05-16

苗药夜寒苏（Rhizoma hedychii）是姜科姜花属植物黄姜花（Hedychium flavum Roxb.）的根茎，主要用于治疗虚弱自汗、胃气虚弱、消化不良等症[1]，该药收载于《贵州草药》和《中华本草》[2]中。主要产地为我国云贵川地区，印度亦有分布[3]。目前研究表明，姜花属植物富含挥发油，还有香豆素类、黄酮类、双黄酮类、多种萜类（单萜、倍半萜及二萜类等）化合物[4-9]。王进喜等[10]从夜寒苏中分离到了多种半日花烷二萜类化合物，其中异姜花素D（isocoronarin D）含量较高。现代药理研究发现，异姜花素D可以激活抗氧化反应元件[11-14]。笔者对苗药夜寒苏药材中具有抗氧化活性物质的含量进行分析，为该药材的后续开发及质量标准的建立提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。试验药材（共10批）采于贵州省黔东南州各地，经贵阳中医学院王祥培教授鉴定为姜科姜花属植物黄姜花（Hedychium flavum Roxb.），具体见表1。

1.1.2 主要仪器。Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），配Waters e2696 PDA检测器（美国waters公司）；梅特勒-托利多 XA105DU电子分析天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；SK7200HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；DHG9070B型恒温鼓风干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司）。

1.1.3 主要试剂。异姜花素D对照品由黔东南州民族医药研究院实验室自制，纯度经HPLC面积归一化法测定，含量>98%，使用前置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重。甲醇、乙腈（霍尼韦尔贸易（上海）有限公司，色谱纯）；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备。称取异姜花素D对照品适量，精密称定，加色譜甲醇配制成含异姜花素D 204.6 μg/mL的对照品储备液。

1.2.2 供试品溶液的制备。取本品粉末（过3号筛）约5.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇30 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率150 W，频率50 kHz）30 min，取出，放至室温，再称定质量，用无水乙醇补足损失的质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.3 色谱分析条件。采用Waters symmetry shieldTM RP 18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm） （美国waters公司），流动相为乙腈（D）-水（A），流速1.0 mL/min，梯度洗脱（0～30 min，60% D；30～40 min，100% D；40～60 min，100% D）；柱温15 ℃；检测波长225 nm；进样量10 μL。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1 系统适应性试验。取供试品溶液1 mL，在 “1.2.3” 色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。

1.2.4.2 线性关系考察。精密吸取对照品储备液，使之配制成204.600、102.300、20.460、10.230、2.046 μg/mL的对照品溶液。取各浓度的混合对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，在 “1.2.3” 项色谱条件下，测定峰面积。以各对照品峰面积为纵坐标、对照品浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.4.3 精密度试验。取同一份对照品溶液，在 “1.2.3” 项色谱条件下，连续进样6次，记录峰面积，并计算峰面积的RSD。

1.2.4.4 稳定性试验。取供试品溶液1 mL，室温分别放置0、2、4、6、8、12、24 h后进样，记录峰面积，计算峰面积的RSD。

1.2.4.5 重复性试验。取同一批黄姜花药材粉末约5.0 g，共6份，按 “1.2.2” 方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL进样，测定峰面积，计算含量。

1.2.4.6 加样回收试验。精密称取已知含量的同一批样品9份，每份约5.0 g，分为3组，每组分别加入样品含量一半的80%、100%、120%对照品溶液。按 “1.2.2”方法制备供试品溶液，按“1.2.3” 项下色谱条件进行测定，计算加样回收率。

1.2.5 样品含量测定。精密称取10批黄姜花样品5.0 g，分别按 “1.2.2”方法制备供试品溶液，按“1.2.3” 项下色谱条件进行测定，计算各供试品中异姜花素D的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 系统适应性试验。由图1可见，在 “1.2.4.1” 条件下，样品中各待测组分与相邻峰的分离度均>1.5，拖尾因子在0.95～1.05，塔板数按异姜花素D峰计算不低于4 000。异姜花素D出峰时间为40.22 min。

2.1.2 线性关系考察。按 “1.2.4.2” 方法操作，以各对照品峰面积为纵坐标（Y）、对照品浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得出线性回归方程为Y=22.699X+3.3385（R2=0.999 8），表明各化合物在相应浓度范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验。按照 “1.2.4.3” 方法操作，得出异姜花素D的峰面积均值为1 101.29，峰面积的RSD为1.7%，表明仪器的精密度良好。

2.1.4 稳定性试验。按照 “1.2.4.4” 方法操作，得出异姜花素D的峰面积均值为1 211.49，峰面积的RSD为1.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 重復性试验。按照 “1.2.4.5” 方法操作，计算得出异姜花素D含量的RSD为2.0%，表明方法重复性良好。

2.1.6 加样回收试验。按照 “1.2.4.6” 方法操作，结果显示（表2），异姜花素D的平均加样回收率为96.55%，RSD为1.9%，表明方法的准确度良好。

2.2 样品含量测定 由表3可知，此次采集到的夜寒苏药材中异姜花素D含量差异较明显，不同地点采集的夜寒苏药材中异姜花素D含量最高的为0.638 5 μg/g，最低为0.031 4 μg/g，两者相差20倍。秋冬季节采集的样品中姜花素D含量明显高于夏末采集的样品。

3 讨论与结论

为了确保最大量地提取出异姜花素D，分别考察了超声、加热回流、冷浸3种提取方式，不同浓度的甲醇、乙醇等溶媒，提取时间以及提取溶剂体积。通过比较，最终的提取方案为：黄姜花药材粉末（过40目筛）约5 g，精密加入30 mL无水乙醇，称定重量，超声提取30 min，静置后补足重量，滤过，滤液作为供试品溶液。

在色谱条件的选择过程中，分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水等流动相，结果发现，乙腈-水溶液梯度洗脱分离效果好，能使异姜花素D达到基线分离。此外，在检测波长的选择时，对异姜花素D待测成分在200～400 nm进行紫外全波长扫描后发现，异姜花素D在225 nm处整体紫外吸收良好，因此最终选择225 nm作为检测波长。

该研究所用样品分别采至贵州省黔东南州各个地区。通过分析发现，收集到的药材中均含有异姜花素D。此外采集到的夜寒苏药材中异姜花素D含量差异较明显，不同地点采集的夜寒苏药材中异姜花素D含量最高的为0.638 5 μg/g，最低为0.031 4 μg/g，两者相差20倍。秋冬季节采集的样品中姜花素D含量明显高于夏末采集的样品，此外贵州黔东南州地貌属于我国西部高原山地，地势西高东低，自东南部向北、东、南三面倾斜。特定的地理位置和复杂的地形地貌，使贵州的气候和生态条件复杂多样，在此状态下夜寒苏的生长受多方面的影响，因此该成分在药材中含量差异较为明显。

该试验采用HPLC法测定黔产夜寒苏中异姜花素D含量，线性关系良好，相关系数均在0.999 8以上，精密度、重复性、回收率符合含量测定要求，样品稳定性好。

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