市售鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

摘要 [目的]通过对石河子地区市售鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性的分析，评估该区域鲜牛奶的安全性。[方法]采用稀释涂平板法分离金黄色葡萄球菌，结合接触酶、兔血浆凝固酶试验，nuc基因扩增，16S rRNA基因测序进行鉴定。同时，选用K-B纸片法测定分离菌株的耐药性。[结果]从10份样品中分离得到金黄色葡萄球菌16株。其中，47.8%的菌株表现为多重耐药，12株金黄色葡萄球菌对头孢他啶具有耐药性。[结论]样品中金黄色葡萄球菌多重耐药性严重，应该采取相应的措施加以监管。

关键词 牛奶；金黄色葡萄球菌；分离鉴定；耐药性

中图分类号 TS207.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0173-03

Isolation， Identification and Antibiotic Resistance Analysis of Staphylococcus aureus in Commercially Available Fresh Milk

GAO Xuan

（Agricultural Products Quality and Safety Testing Center of Midong District， Urumqi， Xinjiang 830000）

Abstract [Objective]Through the analysis of the isolation，identification and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from commercial available fresh milk in Shihezi area， the safety of fresh milk in the region was evaluated. [Method]Staphylococcus aureus was isolated by dilution plate method and catalase test and coagulase test， nuc gene amplification and 16S rRNA gene sequencing were performed. At the same time， the KB disk method was used to determine the antibiotic resistance of the isolates. [Result]Sixteen strains of Staphylococcus aureus were isolated from 10 samples. Among them， 47.8% of the strains showed multidrug resistance， and 12 strains of Staphylococcus aureus were resistant to ceftazidime. [Conclusion] Staphylococcus aureus in the sample has serious multidrug resistance， and appropriate measures should be taken to supervise and administrate it.

Key words Milk；Staphylococcus aureus；Identification；Antibiotic resistance

作者简介 高璇（1988—），女，山东金乡人，助理农艺师，从事农产品检测研究。

收稿日期 2018-05-20

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性细菌，在自然界中广泛存在，可以产生多种毒素和酶，致病性很强。据报道，近年来由金黄色葡萄球菌引起的细菌性感染占第二位，仅次于大肠杆菌[1]。同时，在不清洁的环境中金黄色葡萄球菌频繁地污染食品，如肉、禽、蛋、奶及其制品，从而引起多种感染，包括皮炎、胃肠炎和中毒性休克综合征等[2]。金黄色葡萄球菌能产生高温灭菌不能破坏的肠毒素，可对人体造成危害[3]。作为食源性致病菌，金黄色葡萄球菌的耐药问题也已成為影响公共卫生的重大难题[4-5]。我国奶牛专业型的大规模化养殖相对较少，尤其在游牧民族聚居的地方主要以小规模的方式自由散养。非专业型的养殖大部分圈舍卫生条件差，挤奶方式、规律不科学，很容易引起奶牛乳房被金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等感染，导致奶牛患乳房炎。奶牛乳房炎往往引起奶牛泌乳减少或者停止，甚至结束奶牛的产乳生涯。青霉素、链霉素、红霉素、氯霉素等抗生素常常用于奶牛乳房炎的治疗。长期使用相同的抗生素会引起耐药性微生物的富集，并且在人、奶牛、牛奶之间循环传播[6]。近几年，不同的“超级细菌”不断被发现，由其引起的感染性疾病严重威胁人类健康[7]。因此，牛奶、牛乳房炎来源的病原微生物及其耐药性引起了广大学者的关注[8-10]。笔者对石河子地区市售鲜牛奶中金黄色葡萄球菌进行分离、鉴定及耐药性分析，掌握牛奶中金黄色葡萄球菌的分布及菌株耐药性，为牛奶安全性评估及抗生素的使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；PCR扩增试剂及引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他分析或生物纯化学试剂购自Solarbio公司；抗生素纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Tprofessional PCR仪，德国Biometra公司；PowerPac Universal水平电泳仪、Gel Doc TM XR凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；Fresco21型离心机，德国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集。

从市场散售储奶桶中无菌移取50 mL样品于100 mL灭菌离心管，编号、封口后置于冷藏盒中，2 h内运回实验室进行处理。

1.3.2 分离纯化。

参考文献[11]，移取25 mL均匀的牛奶样品置于装有225 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，150 r/min振荡混匀10 min，制成10-1梯度的样品稀释液，移取1 mL稀释液用装有9 mL灭菌生理盐水的试管进行稀释，得到10-2梯度稀释液。原液、10-1、10-2这3个梯度移取200 μL均匀涂于Baird-Parker平板，37 ℃倒置培养36 h。挑取表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2～3 mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，边缘浅色，用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感特征的单菌落进行转接纯化3次后，在营养肉汤中补充25%的无菌甘油保藏于-80 ℃超低温冰箱。

1.3.3 接触酶及兔血浆凝固酶试验。

挑取纯化后的单菌落溶于3%的H2O2溶液中，1 min内产生气泡，则为接触酶阳性，反之为阴性。接触酶阳性菌株分别接种至5 mL BHI培养基，36 ℃培养24 h，移取500 μL至细菌微量生化鉴定管（兔血浆），封口并置于37 ℃，每30 min观察一次，直至6 h。如呈现凝固或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果，否则为阴性，试验设置3个重复。

1.3.4 Nuc基因检测。

参考Brakstad等[12]的方法，提取接触酶、兔血浆凝固酶阳性菌株的基因组DNA。采用特异性引物Primer 1（5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′）和Primer 2（5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′）对金黄色葡萄球菌的nuc基因进行PCR扩增。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，目标片段为267 bp。

1.3.5 16S rRNA基因扩增、测序。

通过细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行16S rRNA基因的扩增。扩增体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL；引物各1 μL，DNA模板50 ng，ddH2O 补足25 μL。扩增反应：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性 1 min，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，30个循环；72 ℃终延伸7 min。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司纯化后进行测序，测序结果利用BLAST进行在线序列同源性分析[13]。

1.3.6 耐药性检测。

将金黄色葡萄球菌接种至10 mL BHI培养基，37 ℃富集24 h。用生理盐水调整菌液浓度至（1.5～2.0）×108 CFU/mL，移取200 μL均匀涂布于TSA培养基上，将10种抗生素纸片分别等距贴于平板表面，静置30 min，37 ℃培养24 h， 测定抑菌圈直径，试验设计3个平行。根据国际现行的临床实验室标准化协会（简称 CLSI）[14]制定的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》判定菌株对抗生素的敏感性。

2 结果与分析

2.1 菌株分离

10份鲜牛奶中分离纯化得到23株疑似菌株，6份样品检测到金黄色葡萄球菌，检出率为60%。其中， NN9样品未检测到菌株，从NN3、NN4、NN7样品中分离的菌株接触酶、兔血浆凝固酶试验均呈阴性，不符合金黄色葡萄球菌的特征。接触酶、兔血浆凝固酶试验阳性菌株16株（表1）。

2.2 Nuc基因

Nuc基因扩增结果如图1所示，菌株NN1-3、NN5-2扩增结果为阴性，其余14菌株为阳性，目标片段介于200～300 bp。

2.3 16S rRNA基因测序结果

16S rRNA基因测序序列比对结果表明，16株纯培养物均为金黄色葡萄球菌，与GenBank数据库中已知序列的相似性为99%～100%（表1）。

2.4 金黄色葡萄球菌耐药性

金黄色葡萄球菌耐药性统计见图2，菌株NN2-1对所测10种抗生素均敏感，25%的菌株對1～2种抗生素表现为耐药，11株金黄色葡萄球菌表现为多重耐药（47.8%）。其中，2株菌株对6种抗生素具有耐受性，2株菌株可耐受5种抗生素。16株金黄色葡萄球菌对IMP、AMX、STR均敏感，12株菌株对CAZ耐药，11株耐受PEN，其余抗生素耐药性菌株为4～9株。张倩等[15]对石河子地区奶牛乳房炎源的金黄色葡萄球菌进行了耐药性分析，结果表明，青霉素和红霉素耐药率分别为71.67%、46.67%，与该研究结果（68.8%和37.5%）较为接近。

3 结论

该研究10份鲜牛奶中6份样品共检测到16株金黄色葡萄球菌，47.8%的菌株表现为多重耐药。其中，对头孢他啶（CAZ）和青霉素（PEN）耐药的菌株分别为75.0%和688%。

奶牛的乳房炎严重影响牛奶的产量和质量，制约奶牛养殖业的发展。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎主要病原菌之一，由其引起的乳房炎占50%以上[16]。在生产实践中，饲养者通过长期的抗生素给药来预防奶牛患乳房炎，以此增加养殖效益。因此，大量的抗生素耐药性微生物在奶牛中产生，并且耐药性基因出现水平和垂直的传播，多重耐药性病原微生物富集，通过牛奶、排泄物等进入自然环境，严重威胁人类健康。该研究结果表明，该区域牛奶中金黄色葡萄球菌耐药性严重，尤其，对青霉素、杆菌肽等至今仍被临床广泛用于治疗人畜感染性疾病的抗生素耐药性菌株比例较高。由此得出，需要对奶牛养殖业采取一定的卫生和抗生素管理及相关知识的普及措施，并加大对牛奶相关安全指标的监管力度。

46卷27期 高 璇 市售鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

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