固定化四爿藻的制备及其去除养殖废水中氮?磷的效果

李陈清 王珺 陈国华 梁业松 梁俊 海靖涛

摘要[目的]探究固定化四爿藻去除养殖废水中氨氮（NH4+-N）、亚硝酸氮（NO2--N）和活性磷酸盐（PO43--P）的效果。[方法]采用海藻酸钠固定化包埋技术开展了四爿藻固定化培养，探究了藻球直径、藻细胞包埋密度、海藻酸钠浓度及氯化钙浓度等条件对四爿藻固定化培养的影响。同时测定了固定化四爿藻去除养殖水体中NH4+-N、NO2--N、PO43--P的效果。[结果]四爿藻固定化培养的优化条件为藻球直径为4 mm、藻细胞包埋密度为1.82×104个/mL、海藻酸钠质量浓度为10 g/L及氯化钙浓度为20 g/L；在石斑鱼养殖废水中引入固定化四爿藻，试验第3天，NH+4-N去除率达98.87% 、NO2--N去除率达98.33%和PO43--P去除率达83.70%。[结论]采用海藻酸钠固定化包埋技术不影响四爿藻的生理活性；固定化四爿藻应用于净化养殖水环境具有很好的前景。

关键词四爿藻；固定化；氮；磷；去除率

中图分类号X703文献标识码A文章编号0517-6611（2018）05-0081-04

Abstract[Objective]To investigate the effects of immobilized Tetraselmis chui on removing nitrogen（N） and phosphorus（P） from aquaculture wastewater. [Method]Embedding carry of sodium alginate was used to immobilize microalga Tetraselmis chui， and then studied the effects of embedded microalgal particle diameter， cell density of embedded microalgae， concentrations of sodium alginate and calcium chloride on the cultivation of immobilized Tetraselmis chui. [Result]The effects of immobilized Tetraselmis chui was with immobilized microalgal particle diameter of 4 mm，immobilized Tetraselmis chui on removing NH4+N， NO2-N and PO43-P from aquaculture wastewater were also investigated. The results showed that the optimal cultivation condition of 1.82×104 cells/mL embedded cell density， 10 g/L sodium alginate， and 20 g/L CaCl2. Furthermore， the immobilized Tetraselmis chui was also used for the treatment of grouper breeding wastewater，and the removal efficiencies of NH4+N、NO2-N and PO43-P reached 98.87%， 98.33%， and 83.70% on the third day， respectively. In conclusion， the immobilization technology with sodium alginate had no impacts on the physiological activity of Tetraselmis chui. [Conclusion]Thus， immobilized Tetraselmis chui has potential to be applied in the treatment of aquaculture wastewater.

Key wordsTetraselmis chui；Immobilization；N；P；Removal rate

細胞固定化技术是将游离的细胞固定或包埋在载体上，细胞同载体处于相对静止状态的一种化学处理工艺[1]。藻类固定化技术起始于20世纪80年代，早期主要应用于生化生产和能源提供[2]。在环境领域主要应用于废水处理和生物监测，具有反应速度快、固液分离效果好、运行稳定性高等特点[3-4]。目前，在水产养殖上，国内外已经有较多研究。如孙杰等[5]在西施舌（Coelomactra antiquata）人工育苗中应用固定化海洋微藻可有效吸收降解养殖环境中的氨氮与亚硝酸氮，改善水质，提高苗种的成活率与生长量；黄翔鹄等[6-7]研究表明，固定化波吉卵囊藻和微绿球藻可改善凡纳对虾养殖水质，并提高对虾抗病力。郑莲等[8]研究表明，固定化微绿球藻可有效降低对虾养殖水体中氨氮、亚硝酸氮等有害因子的浓度，同时能抑制弧菌的生长，提高水中溶解氧含量，使水体长时间保持较好的动态平衡状态。

四爿藻（Tetraselmis chui）隶属于绿藻门绿藻纲团藻目衣藻科四爿藻属，是一种增殖速度很快的单细胞绿藻，能进行光合放氧作用，并含有丰富的营养物质，是鱼、虾幼体和贝类的优良饵料[9-10]。氮和磷是藻类细胞的主要营养成分，藻细胞通过吸收环境中的氮、磷等营养物质而不断增殖[11]。因此，某种微藻的增殖与其吸收环境中的氮、磷成正比。影响固定化微藻生长和氮、磷去除效率的内部因素主要是藻种本身生理特征，外部因素主要包括温度、光照、营养条件、藻球规格大小、藻细胞包埋量、藻球用量等方面[12]。笔者以四爿藻为藻种，采用海藻酸钠包埋技术进行固定化，进行了不同藻球规格、接种密度、海藻酸钠浓度及氯化钙浓度等培养条件对固定化四爿藻生长及去除养殖废水中氨氮（NH4+-N）、亚硝酸氮（NO2--N）和活性磷酸盐（PO43--P）的效果，以期为固定化四爿藻应用于养殖废水处理提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试四爿藻取自海南大学海洋学院，原种于2016年4月取自海南省陵水县自然海区，经过微吸管法分离、提纯，扩大培养后备用。

1.2微藻培养条件

培养液采用“宁波大学3号”微藻培养液配方[13]；培养容器为1 000 mL“晶花牌”三角烧瓶；试验用海水取自海口市白沙门自然海区，经过400目筛绢网及脱脂棉过滤、煮沸、自然冷却后使用。培养条件：温度（26±2） ℃，盐度为31.5，pH 8.04，光照度为4 000 lx，光暗周期14 h∶10 h，不充气，每天摇瓶4次，提供碳源及氧气，以保证微藻正常生长。该试验选用石斑鱼苗养殖废水，各试验均设3个平行组。

1.3试验方法

1.3.1

固定化藻胶球的制备方法。称取不同质量的海藻酸钠，分别与500 mL蒸馏水混合，加入10 g氯化钠，在 100 ℃ 水浴中分别溶解制成10%、20%和30%海藻酸钠胶体溶液。将处于指数生长期的四爿藻与海藻酸钠胶体溶液分别按1∶4混合均匀，然后用不同规格的注射器将其滴入常温的2% CaCl2 溶液中，即形成不同直径的四爿藻胶球，静置1 h后，用消毒海水洗涤3次，备用。

1.3.2

固定化藻球脱固定化方法。在测定固定化藻细胞密度时需先脱固定化，将固定化四爿藻胶球加入盛有一定量5%柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）化解液的小试管中，摇动，使固定化藻球完全溶解成悬浮状，再用甲醛固定，然后用血球计数板计数藻细胞密度，每个样品计数3次，取平均值。

1.4试验设计

1.4.1

藻胶球直径的筛选试验。在实验室无菌条件下，用不同规格的针头滴成不同大小的藻球，胶球直径大小分别为 2、3、4、5 mm。培養于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培养液，接种400粒胶藻球进行固定化培养，培养10 d后测定其细胞密度。

1.4.2

藻细胞接种量密度试验。在实验室无菌条件下，制备海藻酸钠与四爿藻混合液的终藻细胞密度分别为1.82×102、1.82×103、1.82×104和1.82×105个/mL。培养于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培养液，接种400粒胶藻球进行固定化培养，培养10 d后测定其细胞密度。

1.4.3

海藻酸钠与氯化钙不同浓度的正交试验。在前期预试验的基础上，选取藻球在海水中维持稳定10 d以上的条件，设计海藻酸钠与氯化钙2因素3水平的正交试验（表1），得出最佳的海藻酸钠与氯化钙浓度配比。培养于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培养液，接种400粒胶藻球进行固定化培养，培养15 d后测定其细胞密度。

1.4.4

固定化四爿藻应用于净化水质试验。采用上述试验得到优化的固定化条件制作藻球，培养于盛有1 L石斑鱼苗养殖废水的2 L三角瓶中，每组投放藻球1 000粒，光照度为4 000 lx，光暗周期14 h∶10 h，水温为（26±2） ℃。每天09：00—10：00定时取水样，用0.45 μm 滤膜真空抽滤，测定各项指标。其中，氨氮（NH4+-N）含量采用次溴酸钠氧化法测定；亚硝酸氮含量（NO2--N）采用重氮-偶氮法测定；活性磷酸盐（PO43--P）含量采用磷钼蓝分光光度法测定。具体方法参见文献[14]，共测定7 d。

1.5相关计算

1.5.1

藻胶球破碎率。将固定化四爿藻藻球接入废水中培养，不通气的情况下，每天数出破碎藻球的个数，破碎藻球与总球数之比即破碎率，培养计数10 d。

1.5.2

氮、磷去除率（R）。按下式计算：

R=（C0-Ct）/C0 ×100%

式中，C0为各种形态氮、磷的初始浓度（mg/L）；Ct为取样时氮、磷浓度（mg/L）。

1.5.3

生长速率（K）。根据下式计算：

K=（lgBt-lgB0）/t

式中，B0为接种初始藻细胞密度；Bt为经过t时间培养后的藻细胞密度；t为培养时间（d）。

1.6统计分析

运用Excel 2007软件进行数据处理和图表生成，运用SPSS 17.0软件进行方差分析，并采用Duncan进行多重比较。

46卷5期李陈清等固定化四爿藻的制备及其去除养殖废水中氮·磷的效果

2结果与分析

2.1胶球直径对固定化四爿藻培养的影响

由表2可知，4种不同藻球直径的生长率分别为0.142、 0.146、0.148、0146，直观分析可知直径为4 mm的藻球生长率最高。利用SPSS 17.0软件对其进行单因子方差分析，结果表明该试验设计的藻球直径对固定化四爿藻生长的影响不显著（P>005）。

2.2接种量对固定化四爿藻培养的影响

由表3可知，四爿藻接种量越大，其最终生长量也越大，但生长速率随着接种量的增大而减小。使用SPSS 17.0软件对其进行单因子方差分析，结果表明，不同接种量对固定化四爿藻生长的影响极显著（P<0.01）。综合考虑生长量及生长速率，选用藻细胞密度为1.82×104个/mL为固定化培养的初始密度。

2.3海藻酸钠和氯化钙浓度对四爿藻培养的影响

由表4可知，在接种量相同的情况下，当海藻酸钠浓度为10 g/L、氯化钙浓度为20 g/L时，固定化四爿藻培养15 d后的藻细胞

生长量最大，达1.26×107个/mL，生长率也最高，达0168。

对数据进行单因子方差分析，结果表明，海藻酸钠和氯化钙浓度对四爿藻生长的影响极显著（P<0.01）。

2.4水质因子测定结果

2.4.1NH4+-N含量。

由图1可知，固定化四爿藻对水体中的NH4+-N具有很强的去除力，从培养第2天开始，加藻球试验组水体中的NH4+-N含量急剧降低，第3天NH4+-N去除率达98.87%，而对照组在整个试验过程中NH4+-N变化较小。对数据进行单因素方差分析，结果表明，固定化四爿藻对水体中NH4+-N浓度有极显著影响（P<0.01）。

2.4.2

NO2--N含量。

从图2可以看出，固定化四爿藻对水体中NO2--N具有很强的去除力，从试验第2天

开始NO2--N含量急剧降低，第3天试验组中NO2--N的去除率达9833%，而对照组中的NO2--N含量变化不大。方差分析表明，固定化四爿藻对水体中NO2--N含量有极显著影响（P<0.01）。

2.4.3PO43--P的测定结果。

从图3可以看出，固定化四爿藻对水体中的PO43--P具有很强的去除力，试验第3天，试验组对水体中PO43--P的去除率达83.70%，第4天去除率达92%，对照组的PO43--P在整个试验过程中波动不大。

3讨论

3.1固定化藻胶球的研制

固定化四爿藻胶球的制作工艺对四爿藻的生长及污水处理密切相关。该试验结果表明，藻球直径为 4 mm 时固定化四爿藻的生长量最大，生长率也最大。这与梁晶晶等[15]的研究结果相似，微绿球藻直径为3.5 mm时，生长率最大，藻球生长量呈先升高后降低趋势。经方差分析可知，在该条件下，胶球直径对固定化四爿藻生长的影响不显著（P>0.05）。郑莲等[16]研究表明，藻球直径为4.5 mm时，生长率最大，方差分析可知，3种藻球直径（25、3.5和4.5 mm）对固定化波吉卵囊藻细胞生长的影响不显著（P>0.05）。

不同藻细胞包埋密度对固定化四爿藻生长率影响显著，随着藻细胞包埋密度的增大，生长率逐渐降低，包埋密度为 1.82×102个/mL时，生长率为0.144，藻细胞生长量仅增加了4.82×103个/mL；包埋密度为1.82×104个/mL时，生长率为0.130，藻细胞增长量最大，达3.47×105个/mL；包埋密度增加为1.82×105个/mL时，生长率下降为0.044，藻细胞增长量为3.17×105个/mL。可见，当藻细胞密度增加为5个数量级后，生长率急剧下降且藻细胞增长量降至第2。这是由于随着藻细胞密度的增大，一方面，藻球传质阻力增加，CO2 、O2 及营养盐在藻球中的扩散速度降低；另一方面，藻细胞密度较大的藻球，藻细胞互相遮挡光线，藻球通透性降低而影响藻细胞生长[15]。因而，选择包埋密度为 1.82×104个/mL，而且这个藻细胞密度在一般培养时容易达到，不需要离心浓缩。经多重比较，接种密度對固定化四爿藻生长有显著性差异（P<0.05）。因此，在试验和生产上应根据实际情况选择合适的接种量。

在藻胶球直径为4 mm，包埋藻细胞终密度为 1.82×104个/mL，海藻酸钠浓度为10 g/L（海藻酸钠∶藻液=4∶1），氯化钙浓度为20 g/L的条件下，固定化四爿藻培养15 d后的藻细胞生长量最大，达1.26×107个/mL，生长率也最高。经多重比较，表明不同浓度的海藻酸钠、氯化钙对四爿藻的生长均有极显著影响。

在预试验中，进行了质量浓度分别为10、20 g/L海藻酸钠与藻液不同配比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）试验，结果表明，10 g/L海藻酸钠∶藻液=1∶1 时，不成球；10 g/L海藻酸钠∶藻液=2∶1时，形状不规则，破碎率10%；10 g/L海藻酸钠∶藻液=4∶1时，藻球圆形，破碎率1.5%，藻球生长良好；20 g/L海藻酸钠∶藻液=1∶1 时，藻球圆形，破碎率1.0%，藻细胞生长良好；20 g/L海藻酸钠∶藻液=4∶1 时，破碎率为0，藻细胞生长缓慢。 即在一定浓度范围内，保证胶藻成球的情况下，低浓度比高浓度的海藻酸钠具有更好的生长效率，因此选择相对低浓度的海藻酸钠。原因是较低浓度的海藻酸钠形成胶球的强度较低，在形成网状结构时对可以活动的四爿藻的束缚能力不强，与水体的营养盐交换也更容易，有利于微藻细胞的分裂增殖。此外，还需要强调的是不同厂家生产的海藻酸钠制作胶藻球所需的质量浓度不同，经过试验筛选，该试验选用上海麦克林生化公司生产的海藻酸钠。杨海波等[17] 研究表明，氯化钙浓度越高，形成藻球的时间越短，藻球表面硬度越大，不利于藻生长。该试验也证实了这一观点。

3.2固定化藻胶球去除氮、磷的效果

在养殖废水中引入固定化四爿藻，试验第3天，NH4+-N去除率达98.87%，NO2--N去除率达 98.33%，PO43--P去除率达83.7%。试验组养殖废水中NH4+-N、NO2--N、PO43--P浓度极显著低于对照组（P<0.01）。这是由于试验组中的固定化四爿藻吸收了水体中的NH4+-N、NO2--N、PO43--P，用于生长繁殖。这与前人的研究结果[18-20]一致，固定化微藻可有效降低水环境中的NH4+-N与NO2--N浓度，改善水质 。因此，可以认为固定化四爿藻在水产养殖、育苗等净化水质领域具有很好的应用前景。

4结论

（1）固定化四爿藻培养的优化条件为藻球直径为4 mm、藻细胞包埋密度为1.82×104个/mL、海藻酸钠质量浓度为10 g/L 及氯化钙浓度为20 g/L。

（2）固定化四爿藻去除养殖废水中的NH4+-N、NO2--N和PO43--P的效果极显著。

（3）采用海藻酸钠固定化包埋技术不影响四爿藻的生理活性，固定化四爿藻可以应用于净化养殖水环境。

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