响应面法优化青蛤降血压肽酶解制备工艺

詹秋桂 李杰煌 施鹏飞 雷鸣 罗李王 余方苗

摘要[目的]采用响应面法优化青蛤降血压肽的酶解制备工艺。[方法]以青蛤肉为原料，木瓜蛋白酶为酶种，血管紧张素转换酶抑制率为指标，在单因素试验的基础上，选择pH、酶解时间和料液比为影响因素，进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计，采用响应面法分析3个因素对青蛤降血压肽制备工艺的影响。[结果]木瓜蛋白酶酶解制备青蛤降血压肽的最佳工艺条件为pH 5.8、酶解时间8.4 h、料液比1∶3.1，该条件下酶解产物对血管紧张素转换酶抑制率达93.58%。[结论]该研究为青蛤的高值化利用和降血压肽的制备提供了新思路。

关键词青蛤；木瓜蛋白酶；降血压肽；响应面法

中图分类号S-3文献标识码A文章编号0517-6611（2018）05-0007-03

Abstract[Objective]Enzymatic hydrolysis process for preparing antihypertensive peptides from Cyclina sinensis was optimized by using response surface methodology.[Method]Taking angiotensinconverting enzyme （ACE） inhibition rate as index，a 3factor and 3level BoxBehnken design coupled with response surface analysis was carried out to investigate the effects of pH，hydrolysis time and solidliquid ratio on ACE inhibition rate.[Result]The optimal conditions for preparing antihypertensive peptides from Cyclina sinensis by using papain were as followed：pH 5.8，hydrolysis time 8.4 h and solidliquid ratio1：3.1，and the ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysates were up to 93.58% under these conditions.[Conclusion]This study provides novel ideas for the highvalue use of Cyclina sinensis and preparing antihypertensive peptides.

Key wordsCyclina sinensis；Papain；Antihypertensive peptides；Response surface methodology

我國成年人高血压的发病率约为30%，血压升高易引发脑卒中、心肌梗死、肾衰竭、冠心病等心血管疾病，每年因高血压导致死亡人数高达200万，防治高血压成为研究的热点[1]。血管紧张素转化酶 （ACE）通过催化血管紧张素 Ⅰ 转化为血管紧张素 Ⅱ 和使缓激肽失活调节机体血压，降血压肽是一类具有ACE抑制作用的活性肽[2]。目前，临床广泛应用人工合成的ACE抑制剂普利类药物 （如卡托普利、依那普利和赖诺普利等）具有强降血压作用，但长期服用会产生恶心、眩晕、剧烈咳嗽、肾功能损害等副作用[3]。因此，开发具有ACE抑制活性高、安全无毒副作用的活性物质成为研究的热点。

近年来，海洋生物蛋白通过酶解法制备ACE抑制肽的研究得到极大关注，目前，研究人员已从海洋鱼类如鲑鱼[4]、金枪鱼[5]、太平洋鳕鱼[6]，贝类如贻贝[7]、四角蛤蜊[8]，藻类如螺旋藻[9]、裙带菜[10]等不同海洋来源蛋白[11]中制备分离出高活性的ACE抑制肽。青蛤（Cyclina sinensis）是广泛分布于我国沿海常见的贝类，属软体动物门双壳纲帘蛤目帘蛤科。青蛤提取物具有抗氧化[12]、抗肿瘤[13]、降血压[14]和提高机体免疫作用[15]等功效。笔者在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计试验对木瓜蛋白酶酶解青蛤制备ACE抑制肽的工艺进行了优化，以期为进一步从青蛤中制备、分离纯化得到高活性 ACE抑制肽奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料。青蛤购于舟山老碶菜场；血管紧张素转换酶ACE （来源于兔肺）、马尿酸和马尿酰-组氨酰-亮氨酸 （N-Hippuryl-His-Leu，HHL）、三氟乙酸均购于Sigma公司；木瓜蛋白酶购于亚太恒信生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；硼砂、氯化钠和硼酸等为国产分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2仪器。1260型高效液相色谱仪（HPLC），美国安捷伦公司；HH-6型恒温水浴锅，江苏金坛市成辉仪器有限公司；Milli-A20型超纯水系统，美国默克密理博公司；CF16RN型高速冷冻离心机，日立仪器有限公司；AUW-120型电子天平，日本岛津（上海）有限公司；Delta-320型pH计，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1工艺流程。青蛤→去壳→清洗→匀浆→异丙醇脱脂→纯水泡洗至无味→酶解→灭活→冷却→离心取上清液→冷冻干燥→青蛤降血压肽。

1.2.2青蛤酶解工艺。青蛤去壳取肉，洗净匀浆并用异丙醇脱脂6 h，于12 000 r/min、4 ℃条件下离心8 min，收集沉淀，纯水洗净至无异丙醇味备用。称取适量脱脂固体，选用木瓜蛋白酶，在温度55 ℃、pH 6.0、料液比1∶3.0（g/mL）、时间8 h、加酶量2 000 U/g条件下进行酶解，酶解结束后，于沸水浴中灭活15 min，冷却至室温后于12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，收集上清液，冷冻干燥得到青蛤降血压肽。

1.2.3HPLC法檢测青蛤降血压肽ACE抑制率。参照张艳萍等[7]报道的方法并根据试验条件进行修改：取

120 μL 5.0 mol/L HHL溶液于1.5 mL离心管中，加入30 μL青蛤降血压肽冻干粉溶液（5.0 mg/mL），混合均匀后于37 ℃恒温水浴中预热5 min，加入10 μL 0.1 U/mL ACE溶液，混合均匀后于37 ℃恒温水浴锅中反应1 h，结束后加入150 μL 1.0 mol/L HCl淬灭反应，得到抑制剂反应液。用30 μL硼酸缓冲盐溶液 （0.1 mol/L，pH 8.3，含0.3 mol/L NaCl）代替抑制剂提取液作空白对照组，样品溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样到HPLC系统检测。ACE抑制率计算公式为：

ACE抑制活性=（E-Y）/E×100%

式中，E为空白组中马尿酸的峰面积（mAU·s）；Y为抑制剂组中马尿酸的峰面积（mAU·s）[14]。

1.2.4单因素试验。在pH 6.0、加酶量2 000 U/g、料液比1∶3、时间8 h的条件下考察酶解温度（45、50、55、60、65 ℃）对青蛤降血压肽制备条件的影响；在pH 6.0、加酶量2 000 U/g、料液比1∶3.0、温度55 ℃的条件下考察酶解时间（2、4、6、8、10 h）对青蛤降血压肽制备条件的影响；在加酶量2 000 U/g、料液比1∶3.0、温度55 ℃、时间8 h的条件下考察pH（4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）对青蛤降血压肽制备条件的影响；在pH 6.0、温度55 ℃、料液比1∶3.0、时间8 h的条件下考察加酶量（1 000、2 000、3 000、4 000和5 000 U/g）对青蛤降血压肽制备条件的影响；在pH 6.0、温度55 ℃、时间8 h、加酶量2 000 U/g的条件下考察料液比（1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0和1∶5.0）对青蛤降血压肽制备条件的影响。

1.2.5响应面试验设计。综合考虑5个单因素试验结果，选取影响显著的pH（A）、酶解时间（B）和料液比（C）3个因素进行优化，根据Box-Benhnken试验设计原理，以ACE抑制率为响应值进行优化，设计因素与水平见表1。

1.2.6数据处理。利用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行处理与分析。

2结果与分析

2.1单因素试验结果单因素试验获得青蛤降血压的制备条件为：温度55 ℃，时间8 h，加酶量4 000 U/g，料液比1∶30，pH 6.0，其中pH、酶解时间和料液比3个因素对木瓜蛋白酶酶解青蛤制备ACE抑制肽的影响最大。

2.2响应面分析结果对木瓜蛋白酶酶解青蛤制备降血压肽的试验条件进行响应面分析，具体试验方案及结果见表2。

采用Design-Expert 8.0软件对上述结果进行整理和数据分析，选用二次回归模型进行拟合，方差分析结果见表3。

利用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行分析处理，得到响应面法优化青蛤降血压肽的二次多元回归方程：Y=91.28+5.97A-2.40B+3.17C-3.47AB-0.045AC+598BC-11.19A2-7.03B2-1.91C2。由表3数据分析可知，回归方程因变量和自变量之间的线性关系显著（R2=0.863 8），方程的“Prob>F”=0.023 5（<0.05），说明该回归

方程显著。失拟项的“Prob>F”=0.000 1（<0.05），说明方

程对试验的拟合度较好，该试验方法可靠。

2.3酶解提取青蛤ACE肽参数的确定

通过软件对回归方程的数据分析，得到交互因素相应曲面图及相应的等高线（图1～3）。利用Design-Expert 8.0在设定因素水平内，对数据进行相应分析，得出最佳酶解青蛤制备降血压肽的试验条件为：pH 5.8、酶解时间8.4 h、料液比1∶3.1，此时青蛤ACE肽的ACE抑制率达93.58%。在此基础上进行3次平行试验，相对误差小于0.50%，说明建立的回归方程能够真实地体现pH、酶解时间和料液比3个因素对青蛤ACE肽酶解提取过程的影响，为青蛤的高效利用提供了理论依据。

3结论

青蛤具有很好的食用价值和药用价值，该研究通过最佳酶筛选、单因素水平确定、响应面模型建立、回归方程分析等试验分析过程，研究了pH、料液比、酶解时间等因素对青蛤降血压肽酶解提取过程的影响，得出模型回归方程：Y=91.28+5.97A-2.40B+3.17C-3.47AB-0.045AC+5.98BC-11.19A2-7.03B2-1.91C2。通过F检验和方差分

析，证实该二次模型能够很好地反映各因素对酶解法提取青蛤降血压肽过程的影响。

优化后的最佳酶解提取青蛤降血压肽的工艺组合为pH 5.8、酶解时间8.4 h、料液比1∶3.1，此时青蛤ACE肽的ACE抑制率达93.58%，在此基础上进行3次平行试验，相对误差小于0.50%。

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