A549细胞中Dectin—1受体在烟曲霉刺激后的表达规律

刘彦希　王硕　韩黎　韩雪琳　孙群

摘要：为明确烟曲霉感染肺上皮细胞过程中宿主与病原菌烟曲霉之间的相互作用，该研究探究在烟曲霉孢子内化侵入肺上皮细胞过程中细胞表面dectin-1受体的表达随时间的变化规律及其与侵入孢子的空间位置关系。通过RT-PCR的方法检测烟曲霉孢子刺激Ⅱ型肺上皮细胞A549后不同时间的mRNA水平變化，以及利用荧光显微镜观察烟曲霉孢子侵入A549细胞后其周围dectin-1的分布情况。结果表明：在该侵入过程中，A549细胞中dectin-1的mRNA表达水平无显著性变化，但其可在孢子周围形成“吞噬环”。因此，在烟曲霉内化侵入肺上皮细胞的过程中，dectin-1的表达不发生变化，这与人支气管上皮细胞中dectin-1的诱导型表达增加现象不同；但在烟曲霉孢子周围，dectin-1发生聚集，这种模式识别受体在病原体周围的聚集可能会促进吞噬。关键词：A549细胞；dectin-1；烟曲霉；吞噬

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2018）05-0058～05

0引言

烟曲霉在环境中广泛存在，营腐生生活，是一种重要的条件性致病真菌。由于烟曲霉分生孢子颗粒微小，可飘浮在空气中，极易通过呼吸道进入人体引起肺部感染。虽然人们每天都会吸入烟曲霉孢子，但正常的免疫系统可快速有效地应答并阻止真菌的生长和侵袭，然而在免疫系统有缺陷的病人中，烟曲霉感染造成的侵袭性曲霉病的死亡率高达90%。

在烟曲霉进入肺部的过程中，首先接触到是呼吸道上皮细胞，如支气管上皮细胞或肺泡上皮细胞。这些人体上皮细胞是抵御病原微生物入侵的第一道防线，在机体天然免疫反应中发挥了重要作用，但与巨噬细胞、中性粒细胞等淋巴细胞相比，上皮细胞介导的天然免疫机制远未阐明。烟曲霉孢子颗粒微小，能诱导细胞骨架发生改变而内化侵入肺上皮细胞，并引起炎症因子释放、呼吸暴发等一系列天然免疫反应，但其具体调节机制和可能触发的信号转导通路仍不清楚。

在烟曲霉与肺部细胞相互作用的过程中，细胞表面的模式识别受体如c型凝集素样受体（dectin-1，dectin-2，甘露糖受体等）、toll样受体（TLR2，TLR4，TLR6等）、NOD样受体（NLRP3，NLRP4，NOD2等）发挥了重要的作用。这些模式识别受体可以识别各种真菌的组分，如β-葡聚糖、甘露糖、甘露糖蛋白、几丁质以及真菌来源的RNA和未甲基化的DNA。与配体结合后，模式识别受体将启动各种信号级联反应形成免疫应答，再通过吞噬、细胞因子产生和活性氮（氧）产生导致真菌内化。

dectin-1是一种II型跨膜受体，从胞外到胞内依次是C型凝集素样结构域、茎、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸激酶活化基序。最开始人们认为dectin-1是树突状细胞（dendritic cell）上的特异性受体，后其被证实在其他细胞，如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和一些T细胞中也有表达。dectin-1是髓样细胞表面识别真菌细胞壁组分β-1，3葡聚糖的主要受体，可识别包括烟曲霉和白色念珠菌在内的多种真菌，在天然免疫过程中发挥重要作用。

目前关于dectin-1的研究主要集中于免疫细胞，对于上皮细胞表面dectin-1的相关研究较少。本课题组前期通过流式细胞仪和蛋白质免疫印迹法发现在II型肺泡上皮细胞A549中有dectin-1的表达。在此研究的基础上，本文对烟曲霉感染肺上皮细胞A549过程中细胞表面dectin-1的表达规律和其与烟曲霉侵入孢子的空间位置关系进行研究，旨在为烟曲霉侵染肺上皮细胞的感染过程及其机制提供理论及实验依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1细胞系

腺癌人类肺泡基底上皮细胞系（人肺泡上皮细胞）A549为本实验平台自主保存。

1.1.2菌株

可表达GFP绿色荧光蛋白的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCCl3073菌株，受赠于Margo M.Moore教授（加拿大Simon Fraser University）。

1.1.3试剂

dectin-1（N-16）抗体，驴抗山羊IgG-FITC抗体（美国Santa Cruz Biotechnology）；RPMI 1640（1×）细胞培养基，胎牛血清（德国Gibco）；胰蛋白酶（美国Amresco）；多聚甲醛，Triton X-100，TRIzol（美国Sigma）；RNA提取试剂盒（美国Promega）；逆转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒（中国Takara）；青霉素，链霉素（中国浙江丹康）；BSA（中国上海爱必信）。

沙氏葡萄糖液体培养基（SD）：蛋白胨10g，葡萄糖40g，蒸馏水定容至1 L并121℃高压灭菌20min。

沙氏葡萄糖固体培养基（SDA）：蛋白胨10g，葡萄糖40 g，琼脂20g，蒸馏水定容至1 L并121℃高压灭菌20min。

磷酸盐缓冲液PBS（pH 7.4）：氯化钠8 g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，双蒸水900mL，调节pH至7.4，双蒸水定容至1 000mL，121℃高压灭菌20 min。

双抗：青霉素400万U，链霉素400万U，PBS（pH 7.4）40 mL，完全溶解后过滤除菌（1 000倍稀释使用）。

4%多聚甲醛：多聚甲醛4g，PBS（pH 7A）100mL，完全溶解后过滤除菌。

0.1%Triton X-100：Triton X-100 0.1 mL，无菌双蒸水100mL。

5%BSA：BSA 0.25g，PBS（pH 7.4）5mL。

1.1.4引物

本研究所用引物由Pubmed和Primer premierv5.0设计，由华大基因公司合成（如表1所示），其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因。

1.2仪器与设备

CO₂细胞培养箱（F013TIa Series II），生物安全柜（1300 SeriesA2），美国Thermo公司；电热恒温水槽（DK-SD），上海精宏实验设备有限公司；台式冷冻离心机（Centrifuge 5418R），微量移液器，德国Ep-pendoff公司；台式高速冷冻离心机（Allegra X-22R），漩涡混合器，美國Benchmark公司；倒置荧光显微镜（DMIRE2），德国Leiea公司；正置荧光显微镜（BX51），日本OLYMPUS公司；细胞培养皿舨（35ram，24孔板，96孔板），美国Co～ar公司；PCR扩增仪9700，美国ABI公司；实时荧光定量PCR仪（Rad-IQ5），美国Bio-Rad公司；RT-PCR用96孔板、热盖膜，美国Axygen公司：激光共聚焦显微镜A1R+/A1，日本Nikon。

1.3方法

1.3.1烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073孢子膨胀

取1×10⁸个烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCCl3073休眠孢子于5 mL沙氏葡萄糖液体培养基中，放置在37℃摇床，200 r/min，膨胀4h；膨胀结束后，室温下5 000r/min，离心5 min，得膨胀孢子沉淀，使用适量PBS洗3遍，血球计数板计数，4℃冰箱保存备用。

1.3.2烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073膨胀孢子作用A549细胞

将1×10⁶个A549细胞种于35 mm细胞培养皿/六孔板（用于RT-PCR实验）或激光共聚焦专用皿（用于免疫荧光实验）中培养20h后，37℃、PBS润洗细胞两次，加入1 mL 1x107+/mL的烟曲霉（Aspergillus furnigatus）ATCCl3073膨胀孢子-1640完全培养基混合液分别作用0，0.5，1，2h，其中0h作为空白组即不加入膨胀孢子刺激，且每个实验组设置3个平行皿；作用结束后，PBS清洗细胞3遍。

1.3.3RT-PCR

按照1.3.2刺激结束后弃培养上清液，用无菌PBS洗涤细胞3次以去除分生孢子，向每皿加入1 mLTRhol，获得每个皿中A549细胞的总RNA。根据RNA提取试剂盒的标准实验步骤，提取分离并获得每个样品的总RNA。根据逆转录试剂盒标准实验步骤，利用逆转录试剂盒及PCR扩增仪将RNA逆转录合成cDNA。然后按照荧光定量PCR试剂盒标准实验步骤操作，所用的引物如表1所示，内参基因为GAPDH，在实时荧光定量PCR仪中按照以下循环条件进行荧光定量PCR：首先95℃预变性3 min，95℃变性10 s，55℃退火30 s，此预变性一变性一退火过程共40次循环；再以95℃变性1min，55℃退火1min；最后从55℃以0.5～C/s缓慢变性至95℃。

所得Ct值数据采用2^-⊿⊿Ct法进行数据分析：⊿Ct=Ct（dectin-1）-Ct（GAPDH）；-⊿⊿Ct=⊿Ct（对照组）-⊿Ct（实验组），其中对照组为Oh组，实验组为0.5，1，2h组，且-⊿⊿Ct（对照组）为0；计算2^-⊿⊿Ct，其中对照组的2^-⊿⊿Ct为1：所得数据使用GraphPadPrism 5.0分析作图，数据均以均值±sD表示，误差线表示均值的标准误差。使用t检验比较组间差异，并且P<0.05被认为具有显著性差异。

1.3.4免疫荧光

按照1.3.2作用结束的A549细胞用预冷70%甲醇在4℃下固定细胞15 min，0.1%Triton X-100透化细胞5 min，5%BSA室温封闭30 min后避光条件室温孵育一抗（dectin-1抗体1：50稀释）2 h，湿盒避光孵育二抗（驴抗山羊IgG-FITC抗体1：200稀释），DAPI染色液染色3～5 min，滴加抗荧光淬灭封片液后甘油封片，最后激光共聚焦显微镜镜下观察拍片。

2结果与分析

2.1

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073膨

胀孢子作用肺上皮细胞A549不同时间后

dectin-1的表达情况

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073膨胀孢子分别作用肺上皮细胞A549不同时间（0，0.5，1，2h）后，提取每份样品细胞的总RNA，然后通过RT-PcR探究肺上皮细胞中是否有dectin-1的表达及其随膨胀孢子侵入时长变化的表达规律。本实验结果如图1所示，肺上皮细胞A549细胞中有dectin-1的表达；当烟曲霉（AspergiZlus fumigatus）ATCC13073膨胀孢子作用肺上皮细胞0.5，1 h及2h时，dectin-1的mRNA表达水平虽然有上升趋势，但并没有显著差异（P>0.05）。这一结果进一步佐证了早期本实验室通过流式细胞术及Western Blot的方法证明A549细胞表面存在dectin-1的结果，并发现A549细胞表面dectin-1表达量不随烟曲霉（AspergiUus fumigatus）ATCC13073膨胀孢子侵入时间而变化，但其空间位置分布是否发生变化需下一步证明。

2.2烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073膨胀孢子作用肺上皮细胞A549不同时间后dectin-1的空间分布情况

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCCl3073膨胀孢子分别作用肺上皮细胞A549不同时间（0，0.5，1，2h，其中0h作为对照组）后，采用免疫荧光法进一步验证肺上皮细胞中dectin-1的表达及探究其与烟曲霉的空间关系。结果如图2所示，肺上皮细胞A549中的确有dectin-1的表达：并且当烟曲霉膨胀孢子作用细胞时，肺上皮细胞A549表面dectin-1会聚集在孢子周围形成“吞噬环”（图2中红色箭头表示），但不同时间内的表达无差异。

3结束语

在烟曲霉和肺上皮细胞相互作用的过程中，dectin-1可以介导烟曲霉内化侵入肺上皮细胞中，虽然没有发现烟曲霉可以使A549细胞中dectin-1的表达升高，但是通过dectin-1的特异性染色，用激光共聚焦显微镜观察到了烟曲霉膨胀孢子周围有“吞噬环”，这更加直观地证明了dectin-1在烟曲霉内化侵入肺上皮细胞A549过程中，细胞表面的dectin-1会响应烟曲霉孢子的侵入过程，空间上聚集在侵入孢子周围，促进肺上皮细胞A549对烟曲霉孢子的吞噬，也有可能更加快速准确地引起细胞内下游信号通路（如吞噬、炎症因子释放等）的激活，以响应烟曲霉孢子的侵入过程。这一空间分布的变化说明了dectin-1在烟曲霉孢子侵入肺上皮细胞A549的进程中起着重要作用。有研究表明dectin-1在人支气管上皮细胞中表达水平较低，但是在烟曲霉孢子刺激下，dectin-1的表达会明显上调，并且该过程依赖TLR2tm。这与我们的结果不同，可能是由于使用的细胞不同，也可能是由于使用孢子的感染比，以及其刺激时间长达6h和18h，在此状态下，烟曲霉已经萌发出芽并形成菌丝。膨胀孢子与已长出菌丝的孢子表面暴露的病原相关分子模式的种类及其含量是不同的。

一种病原体进入宿主细胞是非常复杂的过程，会有多种模式识别受体识别一种病原相关分子模式，也会有其他种类的模式识别受体识别细胞表面其他病原相关分子模式。不同的模式识别受体可能相互依赖相互协调，也可能具有拮抗作用。能介导烟曲霉进入细胞的主要受体除了dectin-1，还有CR3，而这两种受体之间的相互关系仍不清楚，两种受体下游的信号通路是否存在交叉也会在下一步实验中进行阐明。

（编辑：莫婕）