啶酰菌胺与氟啶胺复配物对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌的增效作用研究

刘妍 张亚 项雅琴 王翀 廖晓兰

摘要 为探明啶酰菌胺与氟啶胺复配物对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌的增效潜力，采用菌丝生长速率法测定啶酰菌胺和氟啶胺复配物对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌的抑制效果，并根据Wadley方法评价复配物增效作用。结果表明：啶酰菌胺和氟啶胺对水稻纹枯病菌均具有抑制作用，其EC50分别为0.483 6 μg/mL和0.054 1 μg/mL。将啶酰菌胺和氟啶胺按照1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶3、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1的比例进行复配，结果表明：按照1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1复配对水稻纹枯病菌均具有增效作用，其中以3∶1和3∶2比例复配增效最佳，增效系数分别为7.7和5.46；以1∶1、1∶3、1∶4、1∶5和2∶3复配对水稻纹枯病菌具有相加作用。啶酰菌胺和氟啶胺对草莓灰霉病菌也具有抑制作用，其EC50分别为1.637 1 μg/mL和0.028 3 μg/mL。将啶酰菌胺和氟啶胺按照上述相同11种比例进行复配，结果显示比例为1∶5、1∶4、1∶1、5∶1、4∶1等8种复配物对草莓灰霉病菌具有相加作用，其中以2∶1和1∶2比例复配相加效果最佳，增效系数分别为1.30和1.00，但比例为3∶2等其他比例复配则对草莓灰霉病菌表现出拮抗作用。

关键词 啶酰菌胺； 氟啶胺； 水稻纹枯病菌； 草莓灰霉病菌； 复配物； 增效作用

中图分类号： S 435.11， S 436.68

文献标识码： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017230

Abstract In order to clarify the synergism of boscalid and fluazinam against Rhizoctonia solani and Botrytis cinerea， the inhibition effects of boscalid-fluazinam mixtures to R.solani and B.cinerea were investigated by mycelial growth rate test. The results showed that they both have notable inhibition effects against R.solani and B.cinerea， with the EC50 values of 0.483 6 μg/mL and 0.054 1 μg/mL， respectively. The mixtures of of boscalid and fluazinam at the ratio of 1∶2， 3∶2， 5∶1， 4∶1， 3∶1 and 2∶1 had synergism to R.solani. The mixtures at the ratio of 3∶1 and 3∶2 demonstrated the best antibacterial activities with the synergistic coefficients of 7.70 and 5.46， respectively. While the mixtures at the ratio of 1∶1， 1∶3， 1∶4， 1∶5 and 2∶3 showed only additive effects. In addition， the boscalid and fluazinam had the inhibition effect against B.cinerea， with the EC50 values of 1.637 1 μg/mL and 0.028 3 μg/mL， respectively. The mixtures at the ratio of 1∶5， 1∶4， 1 ∶1， 5∶1， 4∶1 and other 3 composites showed additive effects against B.cinerea. The ratios with the best additive effect were 2∶1 and 1∶2， with the synergistic coefficients of 1.30 and 1.00， respectively. However， the mixtures at the ratios of 3∶2 and other ratios showed antagonism.

Key words boscalid； fluazinam； Rhizoctonia solani； Botrytis cinerea； mixture； synergism

水稻紋枯病是由立枯丝核菌Rhizoctonia solani侵染引起的一种重要水稻真菌病害，通常在水稻分蘖末期或节间伸长早期开始发病，菌丝在高温高湿条件下侵入叶片，在叶枕下形成圆形、椭圆形或长方形灰绿色水渍状斑点向四周扩张，随着病情发展，病斑中心变成灰白色，边缘呈紫褐色[1]。病原菌菌丝可通过产生侵入钉穿透水稻表皮或直接通过气孔侵入寄主体内，受侵染细胞内原生质产生颗粒物质并裂解死亡[24]。目前，随着杂交水稻的推广，高产品种的应用，耕作制度的变更，环境条件的变化，水稻纹枯病的危害日益加重，一般可使水稻减产5%～10%，严重时可减产30%～50%[5]。

草莓灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea侵染引起的一种重要的草莓真菌病害。病原菌在花期通过表皮或伤口侵入果实、花瓣、叶片等组织造成危害。发病初期在花瓣和花萼处出现水渍状斑点，后期呈褐色斑点且果实腐烂，同时在患病处形成分生孢子。病菌侵染叶片时一般从基部叶缘侵入逐渐形成黄褐色倒“V”字形病斑，侵染花瓣掉落时形成圆形坏死斑点[67]。近期，谢学文等[8]研究发现温室中感病的草莓表现出花萼背面和果枝变红，果实不发育，形成僵果。诱发草莓灰霉病发生的重要因素是湿度，相对湿度为64%时，烂果率低于10%；而相对湿度为80%时，烂果率上升至80%[7]。同时草莓种植密度越大，草莓灰霉病发病率越高；浅沟厢草莓由于排湿系统比深沟厢草莓差，因此发病率高；过量使用氮肥也会造成草莓灰霉病发病加重[9]。一般可使草莓减产20%～30%，严重时可减产50%以上[8]。

水稻纹枯病和草莓灰霉病均是由半知菌亚门真菌侵染引起。水稻纹枯病菌以菌丝繁殖和侵染，主要侵染禾本科农作物；草莓灰霉病菌主要以分生孢子繁殖，通过分生孢子和菌丝侵染，可侵染多种蔬菜、水果和观赏植物[10]。水稻纹枯病菌在不良环境条件下形成黑褐色菌核，在高温高湿环境下发生严重；草莓灰霉病菌在少数情况下会形成菌核，在高湿低温环境下发生严重。

目前，这两种病害主要采用农业防治、生物防治和化学防治，其中化学防治是最重要的方法，不仅可节省劳力和成本，而且能起到立竿见影的效果。井冈霉素是近年来用于防治水稻纹枯病的主要药剂，其主要是抑制水稻纹枯病菌菌丝正常分支并诱导植株产生抗药性[1112]。陈小龙等[12]认为水稻纹枯病菌对井冈霉素不易产生抗药性。但吴婕等[13]通过试验证明四川地区水稻纹枯病菌对井冈霉素的抑制中浓度逐年上升，认为已经产生了抗药性。所以水稻纹枯病菌是否对井冈霉素产生了抗药性这一问题还有待考证。除了井冈霉素外，吉沐祥等[14]研究发现苯醚·己唑醇对水稻纹枯病的防治效果可达56.72%，与噻呋酰胺相当。宋益民等[15]认为250 g/L嘧菌酯悬浮剂对水稻纹枯病的防效可达87.53%，而且丁香菌酯、丙环唑、戊唑醇、甲基硫菌灵和噻呋酰胺等杀菌剂对水稻纹枯病菌也有较好的抑制作用。利用化学药剂防治草莓灰霉病方面，张传博等[16]研究发现乙蒜·丁子香酚、苯醚甲环唑、腐霉利、嘧霉胺、嘧菌环胺和武夷菌素均对草莓灰霉病菌有一定抑制效果，它们的EC50分别为0.075、2.266、3.704、4.083 7、22.771、55.277 mg/L。然而，张亚等[17]发现湖南地区的草莓灰霉病菌已经对多菌灵、腐霉利和嘧霉胺产生抗药性。赵虎等[18]发现南京、镇江地区草莓灰霉病菌已经对多菌灵、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺和醚菌酯产生抗药性。由于过量使用化学药剂，水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌已经对多种化学药剂产生了不同程度的抗药性，为缓解这一现象，寻找新的杀菌剂或新的途径十分必要，而药剂复配是一个很好的延缓抗药性产生的研究方向。

啶酰菌胺是一种新型烟酰胺类内吸性杀菌剂，该药是线粒体呼吸链上的琥珀酸辅酶Q还原酶的抑制剂，通过阻碍三羧酸循环来抑制真菌的呼吸作用[1920]，对灰霉病、菌核病和白粉病等真菌病害具有很好的效果。在过去研究中发现啶酰菌胺在草莓、黄瓜、番茄、葡萄和土壤中的残留量均低于欧盟、韩国和日本制定的最大残留限量[2124]，因此啶酰菌胺是较为安全的杀菌剂。氟啶胺是一种2，6-二硝基苯胺类化合物，对植食性螨类、葡萄孢属、交链孢属和十字花科植物根肿病等有显著防治效果[2527]。许秀莹等[28]研究发现由于土壤对氟啶胺属于物理吸附，所以在土壤中很难淋溶。同时，何建玲[29]研究发现土壤中的腐殖酸和十二烷基苯磺酸钠对氟啶胺光解有促进作用。因此氟啶胺是一种不易随雨水流动污染其他土地和河流、比较安全且对环境危害小的杀菌剂。目前，有关这两种药剂在我国均有一定的用药史，啶酰菌胺用于防治灰霉病的用药史不足20年，而用于防治水稻纹枯病的研究鲜见报道；氟啶胺用于防治灰霉病和水稻纹枯病的报道也相对较少，因此，明确这两种药剂及复配物对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力及增效作用，对于指导农业生产有重要意义。本研究分别测试了啶酰菌胺和氟啶胺对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力，并采用Wadley法评价其复配物增效作用，旨在提高药剂的使用寿命，延缓病菌的抗药性，同时，也丰富了防治两种病害的新药剂。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani AG-1（采自浏阳市北盛镇和长沙县金井镇）和草莓灰霉病菌Botrytis cinerea Pers. ex. Fr.（采自衡东县新塘镇和郴州市北湖区华塘镇）各2株由湖南农业大学植物保护学院生物农药研究室分离、保存。98%啶酰菌胺原药和98%氟啶胺原药，购自上海秦巴化工有限公司。VS-840K-U洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；ME204E分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；1 000 μL移液枪，德国Eppendorf；MJP-250型霉菌培养箱，上海森信实验仪器有限公司；LDZX-75KB灭菌锅，上海申安医疗器械厂。

1.2 啶酰菌胺和氟啶胺毒力测定

利用菌丝生长速率法测定啶酰菌胺和氟啶胺对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力（各选2株菌进行测试）。将啶酰菌胺和氟啶胺用适量丙酮溶解，用含适量吐温-80的无菌水制备成母液，接着按表1所列质量比用无菌水稀释为系列浓度（表1），加入熔化后的灭菌PDA中，制成含药PDA平板。同时设置不加药剂的无菌水空白对照，每处理设3个重复，在平板中央接入直径约7 mm的新鲜菌饼，置于25℃恒温培养箱中避光培养24 h，采用十字交叉法测量菌落直径并计算平均值，按照以下公式计算不同浓度处理下的菌丝生长抑制率，根据所得的抑制率用DPS 6.55软件计算出回归方程和EC50。

菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径增长长度-处理浓度菌落直径增长长度）/对照菌落直径增长长度]×100%。

1.3 最佳配比预选

采用交互测定法进行最佳配比的筛选[3031]。以啶酰菌胺和氟啶胺的EC50为基础，按EC50剂量百分比设置2个单剂和11个混剂，共13个处理（表1），每处理3个重复。毒力测定同1.2，测量各菌落直径增加長度并计算实际抑制率，再根据下列公式计算各配比的毒性比率。

预期抑制浓度=啶酰菌胺EC50剂量实际抑制率×配比中啶酰菌胺EC50剂量百分比+氟啶胺EC50剂量实际抑制率×配比中氟啶胺EC50剂量百分比。

毒性比率=实际抑制率/预期抑制率；毒性比率>1.25时，表现为增效作用；毒性比率<0.75时，表现为拮抗作用；0.75≤毒性比率≤1.25时表现为相加作用。

1.4 复配剂毒力测定

利用生长速率法测定啶酰菌胺和氟啶胺混剂对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力（各选2株菌进行测试）。将啶酰菌胺和氟啶胺按照表1中的比例进行复配，加入熔化的灭菌PDA中，制成含药PDA平板。同时设置不加药剂的无菌水空白对照，每处理设3个重复，在平板中央接入直径约7 mm的新鲜菌饼，置于25℃恒温培养箱中避光培养24 h。按照1.2的测量和计算方法，计算出各复配药剂的EC50和回歸方程，再根据Wadley方法计算增效系数（SR）评价混剂的增效作用。

式中a、b分别代表两种药剂在混剂中所占比例，ob为实际观察值，th为理论值。SR>1.5为增效作用；0.5≤SR≤1.5为相加作用；SR<0.5为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 啶酰菌胺和氟啶胺对两种病菌的抑制效果

试验结果表明，啶酰菌胺和氟啶胺对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌均表现出较好的抑制效果。氟啶胺对水稻纹枯病菌的毒力最强，EC50和相关系数分别为0.054 1 μg/mL和0.986 9；啶酰菌胺对水稻纹枯病菌的EC50和相关系数分别为0.483 6 μg/mL和0.984 6。氟啶胺对草莓灰霉病菌的毒力最强，EC50和相关系数分别为0.028 3 μg/mL和0.985 7；啶酰菌胺对草莓灰霉病菌的EC50和相关系数分别为1.637 1 μg/mL和0.985 1。

2.2 啶酰菌胺和氟啶胺最佳配比的预选

以啶酰菌胺和氟啶胺对水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌的近似EC50（分别为0.48，0.05，1.64和0.028 μg/mL）为基础，依据交互测定法进行最佳配比的筛选。结果表明：啶酰菌胺和氟啶胺按照1∶3和1∶5复配对水稻纹枯病菌表现出增效作用，毒性比率分别为1.25和1.33，按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、3∶2、2∶3、1∶1、1∶2和1∶4复配对水稻纹枯病菌表现出相加作用，毒性比率分别为0.78、0.78、0.87、0.79、0.82、1.02、1.24、1.17和1.15。啶酰菌胺和氟啶胺按照3∶1、2∶1、3∶2、2∶3、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5复配对草莓灰霉病菌表现出相加作用，毒性比率分别为0.86、0.94、0.81、1.01、1.01、1.02、1.09、0.97和1.05，按照5∶1和4∶1复配对草莓灰霉病菌表现出拮抗作用，毒性比率均为0.73（表2）。

2.3 啶酰菌胺和氟啶胺对水稻纹枯病菌的增效作用

啶酰菌胺和氟啶胺比例为1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1时对水稻纹枯病菌表现出明显的增效作用，增效系数分别为1.52、5.46、3.44、2.6、7.7和1.98（表3）。其他配比表现出相加作用。

2.4 啶酰菌胺和氟啶胺对草莓灰霉病菌的增效作用

啶酰菌胺和氟啶胺比例为1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、5∶1、4∶1和2∶1时对草莓灰霉病菌表现出明显的相加作用，其中按照2∶1和1∶2比例复配对草莓灰霉病菌抑制效果最好，增效系数为1.3和1.0（表4）。

3 结论与讨论

本研究结果表明：啶酰菌胺和氟啶胺均对水稻纹枯病菌有较好的抑制作用，EC50分别为0.483 6 μg/mL和0.054 1 μg/mL，其中啶酰菌胺对水稻纹枯病菌的毒力高于陈宏州等[32]得到的结果（EC50为1.069 2 μg/mL）。同时，这两种药剂的毒力也高于井冈霉素（EC5070.2 μg/mL）、戊唑醇（EC500.509 μg/mL）和丙环唑（EC500.045 μg/mL）[11，3334]，表现出防治水稻纹枯病的潜力。

啶酰菌胺和氟啶胺对草莓灰霉病菌的EC50分别为1.637 1 μg/mL和0.028 3 μg/mL，其中啶酰菌胺对草莓灰霉病菌的毒力高于杨敬辉等的测定结果[35]（EC50为3.980 3 μg/mL）。同时，这两种药剂的毒力效果也好于腐霉利（EC503.704 μg/mL）、嘧霉胺（EC504.837 μg/mL）、苯醚甲环唑（EC502.266 μg/mL）、嘧菌环胺（EC5022.771 μg/mL）和武夷菌素（EC5055.277 μg/mL）[16]，具有防治草莓灰霉病的潜力。

啶酰菌胺与氟啶胺按照1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1比例复配对水稻纹枯病菌表现出较高的增效作用。啶酰菌胺与氟啶胺按照2∶1和1∶2比例混合时对草莓灰霉病菌有相加作用。从经济效益和环保的角度考虑，建议田间控制水稻纹枯病可采用啶酰菌胺与氟啶胺2∶1进行配比。尽管啶酰菌胺和氟啶胺复配物对草莓灰霉病菌未表现出明显增效作用，但按照2∶1和1∶2配比仍然有一定相加作用，其中以比例2∶1为最佳配比，增效系数为1.30。

利用复配来防治水稻纹枯病和草莓灰霉病可以减少成本、延缓病原菌抗药性形成，达到更理想和安全的防治效果。啶酰菌胺和氟啶胺的复配物对水稻纹枯病菌的最高增效系数可达7.70，明显高于苯醚甲环唑与己唑醇按照1.5∶1.0复配的增效系数1.14[14]、嘧菌酯与己唑醇按照1∶2复配的增效系数1.55[36]以及5%井冈霉素水剂与85%氯胺磷可溶性粉剂以1∶4复配增效系数2.26[37]。由此可见，尽管目前已经有多种药剂的复配物对水稻纹枯病菌有明显抑制效果，但其增效系数均低于啶酰菌胺和氟啶胺的复配物，所以啶酰菌胺与氟啶胺复配具有进一步开发为新型农药的潜力。啶酰菌胺和氟啶胺的复配物对抑制草莓灰霉病菌的最高增效系数为1.30（EC50为0.286 3 μg/mL），抑制效果与嘧菌环胺和腐霉利按照1∶1和1∶2比例复配（EC50分别为0.062 mg/L和2.005 mg/L）和乙蒜素与苯醚甲环唑按照1∶2和2∶1复配（EC50分别为0.065 mg/L和0.833 mg/L）[16]不相上下，且抑制效果明显优于部分药剂配比的效果。

啶酰菌胺和氟啶胺主要用于对葡萄孢属等真菌病害的防治，本试验结果表明，啶酰菌胺和氟啶胺对水稻纹枯病菌也有很好的抑菌作用，两者复配更是表现出了一定的增效作用，后期可以再探究这两种药剂对其他病原菌是否也具有明显的抑制效果，从而扩展两种药剂的应用范围。另外，啶酰菌胺和氟啶胺混配的增效机制、后期混配产品剂型的研制、产品的环境行为以及检测方法等均有待进一步研究。

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（责任编辑：杨明丽）