解淀粉芽胞杆菌WH1G与咪鲜胺协同防治草莓炭疽病

谷春艳 苏贤岩 杨雪 臧昊昱 陈雨 王学峰

摘要 通过室内测定8种化学药剂和拮抗细菌解淀粉芽胞杆菌WH1G对草莓炭疽病菌的毒力，将毒力最强的化学药剂与WH1G进行复配，探讨复配剂对草莓炭疽病菌的室内毒力及田间防治效果。室内生物测定结果表明，8种常见化学药剂中咪鲜胺对草莓炭疽病菌的毒力最强，其EC50为0.045 3 mg/L，在较低浓度下能有效抑制草莓炭疽病菌的生长，与生防菌有较好的生物相容性；解淀粉芽胞杆菌WH1G对草莓炭疽病菌菌丝生长具有较强的抑制作用，含菌量为1.0×1010cfu/mL时抑制率达89%；将咪鲜胺（0.045 3 mg/L）与解淀粉芽胞杆菌WH1G（2.3×106 cfu/mL）复配，V（咪鲜胺）∶V（WH1G）配比为5∶5时对病菌抑制的增效作用和防治效果最好，毒性比率为1.432，防效为69.94%。复配剂对草莓炭疽病的田间防效达67.91%，显著高于单剂防效，且咪鲜胺使用量只有单剂使用量的1/2，表明二者复配不仅可以提高防效，还能有效减少化学药剂的使用量。

关键词 草莓炭疽病； 解淀粉芽胞杆菌； 咪鲜胺； 协同防治

中图分类号： S 668.4

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017209

Abstract Toxicities of 8 fungicides and Bacillus amyloliquefaciens WH1G against strawberry anthracnose were tested in this study. The mixture of the fungicide with the strongest toxicity and antagonistic bacteria WH1G was detected for its laboratory toxicity and control effect in the fields against strawberry anthracnose. The results showed that the toxicity of prochloraz was the strongest among 8 fungicides with the EC50 value of 0.045 3 mg/L. It could effectively inhibit the mycelia growth of C.gloeosporioides under lower dosage， and was compatible with strain B.amyloliquefaciens WH1G. 1.0×1010cfu/mL WH1G could strikingly inhibit the growth of C.gloeosporioides with the inhibition ratio of 89%. By combining 0.045 3 mg/L prochloraz with 2.3×106 cfu/mL B.amyloliquefaciens WH1G fermentation broth at the volume ratio of 5∶5， the toxicity ratio and the control efficacy were 1.432 and 69.94%， respectively， prior to the rest of the tested reagent combinations. The control efficacy of compound biopesticide was 67.91% against strawberry anthracnose in the field， which was better than that when each of them used alone. Meanwhile， the amount of prochloraz was reduced by 50% compared to that when used alone. Therefore， the combination of prochloraz and strain WH1G can not only reduce the usage of chemicals， but also promote the biocontrol efficacy.

Key words strawberry anthracnose； Bacillus amyloliquefaciens WH1G； prochloraz； synergistic control

由炭疽菌Colletotrichum spp.引起的草莓炭疽病是草莓苗期和移栽期的重要病害，該病主要危害匍匐茎和根冠，造成根冠腐烂，最终导致植株萎蔫死亡[1]。近几年来，由于草莓地连作现象普遍、复种年限延长以及抗病品种缺乏，炭疽病蔓延迅速，已成为草莓苗期的主要病害，严重制约了草莓种植业的健康发展[2]。

目前对草莓炭疽病的防治主要以化学防治为主，多采用咪鲜胺、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯等化学药剂进行防治。使用化学药剂虽在短时期内能达到很好的防效，但同时也会造成果实农药残留、环境污染及病菌产生抗药性等问题[34]。据报道，草莓炭疽病菌已对多种化学药剂产生了抗药性[57]。生物防治不仅对人畜安全，而且具有绿色、环保、作用时间长、病菌不易产生抗药性等优点，因而日益受到人们的关注，但其也存在一些不足，如田间施用后药效发挥较慢、防治效果及防效稳定性差等，这些缺点严重制约了生防制剂的推广[8]。目前针对草莓炭疽病生防菌的研究多数停留在拮抗菌的筛选、鉴定及生物学特性方面[1，3，9]，开发并已登记的生防菌中田间防治效果好的菌株屈指可数[1011]。

利用生物防治与化学防治相结合的防治策略，既能减少化学药剂的施用量、提高生物防治的稳定性，又能达到有效控制病害的效果，综合运用了生物防治与化学防治方法的优点，因此在植物病害防治领域日益受到重视，且取得了较好的进展[1215]，但目前利用生防菌与化学药剂协同防治草莓病害的研究还少有报道[8，16]。据此，本研究拟从农业生产常用的化学药剂中筛选出对草莓炭疽病防效较好并和解淀粉芽胞杆菌生物相容性好的化学药剂进行复配，探讨化学药剂与解淀粉芽胞杆菌协同防治草莓炭疽病的效果，为生产中生物农药与化学农药的综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens WH1G，由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所水稻病害防治课题组分离获得[17]。采用改良的NA培养基（1.0 g牛肉浸膏，5.0 g酵母膏，5.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，10.0 g蔗糖，20.0 g琼脂和1 000 mL蒸馏水，pH 6.8～7.0），在恒温恒湿培养箱28℃中培养。

草莓炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides CF8G，由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所水稻病害防治课题组分离获得。病菌用PDA培养基（马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g和蒸馏水1 000 mL），在恒温恒湿培养箱28℃中培养。

化学药剂：9种化学药剂的含量、剂型及生产厂家见表1。

1.2 药剂毒力测定

采用菌丝生长速率法[18]。分别用97%咪鲜胺原药等8种供试药剂配制含不同梯度浓度药剂的PDA平板。其中97%咪鲜胺原药、98%氟啶胺原药在PDA培养基中的系列梯度浓度设计为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L；97%氟环唑原药及97%戊唑醇原药的梯度浓度设计为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L；96%苯醚甲环唑原药的梯度浓度设计为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L； 95%啶酰菌胺原药、95%腈菌唑悬浮剂及97%吡唑醚菌酯原药的梯度浓度设计为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L，将草莓炭疽病菌菌块（直径5.0 mm）放在含药平板中央，放置于28℃培养箱中培养。采用无菌水作为对照，各处理重复3次。待对照菌落长满培养皿2/3时，采用十字交叉法量取各处理的菌落直径，计算平均抑制率。

平均抑制率=[（对照组菌落直径平均值-处理组菌落直径平均值）/（对照菌落直径平均值-5.0）] ×100%。

1.3 解淀粉芽胞杆菌WH1G对草莓炭疽病菌抑菌活性测定

将解淀粉芽胞杆菌WH1G接种于5 mL改良NA液体培养基中，置于28℃摇床180 r/min培养48 h后用无菌水稀释成菌含量1.0×1010cfu/mL，采用平板对峙法[9] 测定其对草莓炭疽病菌的抑制活性。用直径为5 mm的无菌打孔器在草莓炭疽病菌菌落边缘打取菌饼，接种于PDA平板中央，在距离中心3 cm处对称放置4个直径为5 mm的滤纸片，其中3个滤纸片加2 μL解淀粉芽胞杆菌WH1G菌悬液，另外一个滤纸片滴加2 μL NA液体培养基，另设清水对照，每处理设3次重复，将平板置于28℃恒温箱内培养。待对照菌落长至培养皿2/3时，用十字交叉法测量菌落直径，计算平均抑制率。

1.4 化学药剂对解淀粉芽胞杆菌WH1G生物活性的影响

将1.2筛选出来的对草莓炭疽病菌毒力较强的化学药剂分别配成质量浓度为50、100、150、200 mg/L的改良NA培养基平板，将10 μL解淀粉芽胞杆菌WH1G的菌悬液滴在含药平板中央，用玻璃棒均匀涂布于培养基表面，每处理重复3皿，以加同等体积的无菌水为对照，28℃恒温箱内培养2 d。分别采用平板稀释法检测菌体生长情况，统计并记录菌落数量。

1.5 咪鲜胺与解淀粉芽胞杆菌WH1G复配剂的毒力测定

1.5.1 单剂对草莓炭疽病菌的毒力测定

用无菌水将解淀粉芽胞杆菌WH1G的菌悬液配制成不同含菌量的菌悬液，分别为1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109 cfu/mL。同时将97%咪鲜胺TC配制成不同質量浓度梯度的药液，分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L。

采用生长速率法测定单剂毒力。用十字交叉法测量炭疽菌在含不同质量浓度的咪鲜胺平板及不同含菌量的解淀粉芽胞杆菌WH1G平板上的菌落直径，根据各处理的平均菌落直径计算抑制率。将抑制率换算成抑制几率值。分别根据咪鲜胺质量浓度对数（X）与抑制几率值（Y）、生防菌浓度对数（X）与抑制几率值（Y），采用DPS数据处理系统计算出各处理的回归方程Y=aX+b、EC50及相关系数r。

1.5.2 复配剂对草莓炭疽病菌的毒力测定

根据97%咪鲜胺TC及解淀粉芽胞杆菌WH1G单剂的毒力测定结果，分别配制两种单剂的有效中浓度为药液。再将咪鲜胺与生防菌WH1G按体积比为10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10配成10种配比的复配液。以加入等量无菌水为空白对照，每处理设3次重复。测量各处理平板的菌落直径，计算平均抑制率、预期抑制生长率及毒性比率。根据毒性比率值，判断不同配方的协同作用效果。

毒性比率>1，表示为增效作用；毒性比率<1，表示为拮抗作用；毒性比率=1，表示为相加作用[19]。其计算公式为：

毒性比率=实际抑制生长率/预期抑制生长率。

预期抑制生长率=生防菌WH1G菌悬液EC50剂量实际抑制率×配比中的百分率+咪鲜胺EC50剂量实际抑制率×配比中的百分率。

已有研究结果[2427]表明，化学药剂有助于生防微生物克服自然环境中的各种障碍，弥补生防菌发挥作用慢、田间防效不稳定等缺点，从而更好地发挥生物防治作用。但是对于生防微生物的安全性、质保期、使用规范及实现化学药剂和生防菌协同增效的具体作用机制还有待于深入研究，从而为菌剂更好地开发利用提供指导作用。

草莓炭疽病的防治只有坚持“预防为主、综合防治”的植保方针，以农业防治为基础，运用生物防治和高效低毒农药协同防治的多种措施才能达到理想的防治效果。

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（责任编辑：杨明丽）