低温对球孢白僵菌生物学特性及其对韭蛆毒力的影响

周仙红 范晓杰 曹雨 张思聪 庄乾营 于毅

摘要 本文室内测试了低温对球孢白僵菌高毒力菌株YB8的生物学特性（菌落生长速率与产孢量）及其对韭蛆毒力的影响。结果表明：在8～25℃温度范围内菌落生长速率和产孢量随温度的降低而降低。在25℃时菌落生长速率为3.15 mm/d，产孢量为5.94×106个/mm2。20、23℃下菌落生长速率（1.94、2.91 mm/d）与25℃下相比显著降低（P<0.05），产孢量（4.80×106、5.57×106个/mm2）略有降低，差异不显著（P>0.05），8～17℃下与25℃相比菌落生长速率及产孢量均显著降低（P<0.05）。低温下球孢白僵菌对韭蛆的校正死亡率随温度降低而减小，25℃时韭蛆校正死亡率最高，为45.33%，与其他各温度差异显著（P<0.05）。因此低温对白僵菌生长和韭蛆致病力有显著影响，根据韭蛆的田间发生规律，建议春秋季节韭蛆盛发期使用球孢白僵菌防治韭蛆时应在土壤温度接近或达到25℃时使用。

關键词 球孢白僵菌； 韭蛆； 低温； 菌落生长； 毒力

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017140

Abstract The effects of low temperature on the biological characteristics （colony growth rate and spore yields） of high-virulence strain Beauveria bassiana YB8 and its toxicity against Bradysia odoriphaga were investigated. The results showed that the colony growth rate and spore yields decreased with decreasing temperature in the range of 8-25℃. The highest colony growth rate （3.15 mm/d） and spore yields （5.94×106 spores/ mm2） were recorded at 25℃. The colony growth rates at 20℃ and 23℃ （1.94， 2.91 mm/d） were significantly lower than that at 25℃ （P<0.05）， while the spore yields （4.80×106， 5.57×106 spores/mm2） had no significant difference from that at 25℃ （P>0.05）. The colony growth rate and spore yields in the range of 8-17℃ were significantly lower than those at 25℃ （P<0.05）. Meanwhile， the toxicity of YB8 to B.odoriphaga decreased with decreasing temperature. The highest mortality （45.33%） was recorded at 25℃， which was significantly higher than those at other temperatures （P<0.05）. Based on the occurrence of B.odoriphaga in the field， it was recommended to use B.bassiana in spring and autumn when the soil temperature was close to or above 25℃.

Key words Beauveria bassiana； Bradysia odoriphaga； low temperature； colony growth； toxicity

韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang，属于双翅目，长角亚目，眼蕈蚊科，迟眼蕈蚊属，是葱蒜类蔬菜的重要害虫，幼虫俗称韭蛆，喜食韭菜根部。韭菜迟眼蕈蚊在田间以幼虫（韭蛆）为害，春季主要为害植株叶鞘、幼茎和芽，引起幼茎腐烂、叶片枯黄，而后把茎咬断并蛀入茎内。夏季气温较高，幼虫向下活动，深入鳞茎，造成鳞茎腐烂引起整株死亡。冬季气温低，韭菜迟眼蕈蚊以老熟幼虫越冬[1]。环境，如温度、湿度、降水、寄主植物的品种及覆盖面积是影响昆虫发生发展的主要因素，其中温度和湿度对韭菜迟眼蕈蚊影响较大，适度低温和高湿对其生存有利，而过高温度和湿度或低温、低湿可降低其存活率[2]。冯惠琴等[3]、梅增霞等[4]研究发现20～25℃下韭菜迟眼蕈蚊的种群增长指数和繁殖力较高，说明该温度范围是韭菜迟眼蕈蚊的适宜生长温度，这就是该虫春、秋季发生重的原因之一。

球孢白僵菌Beauveria bassiana属于丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，白僵菌属，是一种能寄生15目149科700多种昆虫和蜱螨类的广谱性的昆虫病原真菌[5]，因此其被公认为目前世界上防治害虫应用较广、最有前途的一种虫生真菌[6]。虫生真菌在其生产过程和田间应用中会受到温度、湿度、光照等环境因素影响[7]，温度影响球孢白僵菌孢子萌发、菌丝生长、产孢繁殖各个生长阶段。球孢白僵菌孢子萌发的温度范围为5～35℃[89]，生长速度一般随温度的升高而加快，温度过低对球孢白僵菌的产孢量影响不大，但容易造成孢子萌发时间推迟、菌丝生长稀疏[1011]。室内外研究发现，适宜球孢白僵菌孢子萌发及菌丝生长的温度，也是防治害虫的最佳温度，低温（17℃以下）或高温时（29℃以上）会抑制球孢白僵菌生长，导致其杀虫效果显著降低[1216]。由于春、秋季是韭蛆为害高峰期，而夏季几乎不发生，因此本文选取实验室储存的对韭蛆致病力强的球孢白僵菌菌株YB8，研究低温对球孢白僵菌生物学特性的影响，同时室内测定了低温下YB8对韭蛆的毒力，旨在为指导田间使用球孢白僵菌防治韭蛆的温度范围提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：球孢白僵菌Beauveria bassiana自亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis上分离获得，经筛选后获得对韭蛆高毒力菌株YB8。菌株保存于山东省农业科学院植物保护研究所4℃冰箱中。使用前用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）在恒温箱中培养形成菌落，培养条件为温度（25±1）℃，光周期L∥D=0 h∥24 h。

供试昆虫：韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang采自山东寿光韭菜田，并于山东省农业科学院植物保护研究所养虫室内用人工饲料[17]连续饲养多代，饲养条件为温度（25±1）℃，相对湿度70%±5%。试验选用健康活泼的3龄幼虫。

1.2 试验方法

1.2.1 低温对球孢白僵菌菌株YB8的菌落生长速率和产孢量的影响

将球孢白僵菌在PDA培养基上活化10 d左右，用直径5 mm的灭菌打孔器在菌落边缘打取菌饼，转接到PDA平板中央，分别置于不同温度（8、11、14、17、20、23和25℃）恒温箱中黑暗培养，每处理5个重复。采用十字交叉法[12]测量菌落直径，每24 h测定1次，共测量10 d，计算菌落生长速率。10 d后用直径5 mm的灭菌打孔器从菌落中心距离边缘1/2处打取菌饼，每个处理取3个菌饼，接入15 mL 含0.05%吐温-80的无菌水中，搅拌使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子浓度，并计算出每平方毫米的产孢量。

菌落增长直径（mm）=菌落直径-菌饼直径（5 mm）；

菌落生长速率（mm/d）=菌落增长直径/培养时间（10 d）；

产孢量（个/mm2）=孢子数/（mL）×15/（π×半径2）

1.2.2 低温下球孢白僵菌YB8对韭蛆的毒力测定

将韭菜假茎剪成1 cm小段放入1×108个/mL的孢子悬浮液中浸泡5 min后放入直径9 cm的培养皿中，培养皿底层用琼脂和滤纸进行保湿，在滤纸上滴加600 μL 1×108个/mL的孢子悬浮液，每皿接入30头健康、活泼的韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫，每处理重复5次，同时设无菌水对照。分别放入8、11、14、17、20、23和25℃，RH =70%±5%，全黑暗恒温箱中饲养，11 d后记录死亡虫数，计算校正死亡率，并收集活虫。以毛笔尖轻触虫体，幼虫不动或身体明显收缩为死亡，记录死亡虫数并计算校正死亡率。

校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）×100%。

1.2.3 数据处理

利用统计软件SPSS 17.0对所得数据进行统计分析。对不同处理间的差异进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukeys-b（K）氏多重比较（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 低温对球孢白僵菌菌落生长速率和产孢量的影响

以25℃作为对照温度，研究低温对球孢白僵菌生长速率和产孢量的影响。表1数据结果表明：7个温度下球孢白僵菌均能生长。25℃时菌落生长速率达到最高，为3.15 mm/d，10 d菌落直径扩展了31.5 mm。球孢白僵菌菌落生长速率随温度的降低而明显降低（F=206.901，df=6，P=0.000）。8℃时菌落生长速率最低，为0.19 mm/d。球孢白僵菌的产孢量随温度的降低而减少，25℃、23℃时与20℃时的产孢量分别为5.94×106、5.57×106、4.80×106个/mm2，且三者相比差异不显著（F=11.617，df=6，P=0.176），8～17℃产孢量与25℃相比明显减少（F=11.617，df=6，P=0.000），其中8℃产孢量最低，为0.89×106个/mm2。因此在供试温度范围内，25℃相比其他温度最适合球孢白僵菌YB8的生长。

2.2 低温下球孢白僵菌对韭蛆的毒力

表2试验结果表明，接种球孢白僵菌后韭蛆校正死亡率随温度的降低而明显降低。

25℃时接种后11 d韭蛆校正死亡率达到最高，为45.33%，与其他温度差异显著（F=214.652，df=6，P=0.000），8、11及14℃下接种后11 d韭蛆校正死亡率为0，而20℃和23℃时韭蛆校正死亡率分别为24.67%、29.33%，两者之间差异不显著（F=214.652，df=6，P=0.678）。因此在供试温度范围内，25℃相比其他温度球孢白僵菌对韭蛆致病力更强。

3 结论与讨论

关于白僵菌对昆虫的毒力研究较多的有蚜虫、粉虱、菜粉蝶、玉米螟等[18]。已有的研究表明，白僵菌生长发育不同时期（如菌絲生长期和产孢期）的最适温度不尽相同。本试验结果表明，供试温度范围内最适合球孢白僵菌生长发育的温度为25℃，从最低生长温度开始，随着温度的升高生长速度提高，产孢量增加，这与前人的研究结果基本一致[7，1213，19]。在一定的温度范围内，白僵菌的侵染力随温度升高而增强[20]，这与本文中25℃时白僵菌孢子萌发率最高、萌发速度最快及对韭蛆的毒力最强的结果一致。

根据韭蛆的田间发生规律[3]以及白僵菌对低龄韭蛆毒力更高这一特点，田间可在春季和秋季韭蛆低龄幼虫[21]时期使用白僵菌，此时山东地区土壤5 cm深度周平均温度为18.5～22.8℃[22]。由于20～23℃下球孢白僵菌对韭蛆的致死率较低，可以加大白僵菌的使用量，这样既保证了白僵菌的最优生长条件，又提高了防治效果。虽然低温下白僵菌对当代韭蛆的毒力较低，但白僵菌孢子在韭蛆体内仍能繁殖、累积，并能垂直传播到下一代[2324]，从而实现持续控制害虫的目标，白僵菌对下一代韭蛆的影响有待进一步研究。

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（责任编辑：杨明丽）