超高效液相色谱串联质谱法测定豇豆中8种农药残留

李强 邱海燕　乐渊 夏西亚　唐良德　曾东强 付步礼　刘奎

摘要

本文建立了超高效液相色谱串联质谱法（UPLCMS /MS）同时测定豇豆中啶虫脒、阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟啶虫胺腈、灭蝇胺、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和烯酰吗啉残留量的方法。样品经乙腈提取，采用ACQUITY_UPLCTMBEH C18色谱柱分离，应用 UPLCMS /MS 正离子扫描进行定性定量分析。结果表明，在0.01～1 μg/mL 范围内，8种农药色谱峰面积与浓度均呈线性相关；3个添加水平下，回收率均在90%以上；8种农药在豇豆中的检出限为0.08～1.81 μg /kg，定量限为0.024～0.603 μg/kg。在实际豇豆样品检测中检测到5种农药残留，本方法灵敏度高、速度快，可为检测豇豆中8种农药残留量提供参考。

关键词

超高效液相色谱串联质谱； 豇豆； 农药； 残留

中图分类号：

O 657.63

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017196

Analyzation of 8 pesticide residues in cowpea by ultra performance liquid

chromatographytandemmass spectrometry

LI Qiang1，2，3， QIU Haiyan1，2， LE Yuan4， XIA Xiya1，

TANG Liangde1，2， ZENG Dongqiang3， FU Buli1，2， LIU Kui1，2

（1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，

Haikou 571101， China； 2. Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，

Ministry of Agriculture， Haikou 571101，China； 3.Key Laboratory of Agricultural Environment andAgricultural Products Safety， Guangxi University， Nanning 530005， China； 4. Analysis &Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China）

Abstract

An analytical method based on ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） was used to analyze residues of acetamiprid， abamectin， emamectin benzoate， sulfoxaflor， cyromazine， difenoconazole， pyraclostrobin and dimethomorph in cowpea. The samples were homogenized and extracted with acetonitrile， the retention of target compounds was performed on an ACQUITY_UPLCTMBEH C18 column by gradient elution， the qualification and quantification were analyzed by spectrometry with electrospray ionization in positive mode. The results showed that the chromatographic peak area was linearly related to the concentration of pesticides in the range of 0.01-1 μg/ mL. Under the 3 adding levels， the recovery rate is above 90%. The limits of detection （LOD） and quantitation （LOQ） were 0.08-1.81 μg/kg and 0.024-0.603 μg /kg， respectively. 5 pesticides residues were detected in the actual cowpea samples. Taken together， the present study suggest that UPLCMS /MS method with high sensitivity and high speed can be recommended to be used for the analysis of the residues of 8 pesticides in cowpea.

Key words

UPLCMS/MS； cowpea； pesticides； residue

豇豆是三亞主要冬种蔬菜之一，三亚优越的环境条件有利于各季节豇豆生长，但同时也使得豇豆上各种病虫害发生猖獗，如苗期根腐病，成株期锈病、煤霉病和炭疽病等，虫害则以斑潜蝇和蓟马为害最严重[1]。据当地情况，大量的杀虫剂如啶虫脒、阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（甲维盐）、氟啶虫胺腈、灭蝇胺和杀菌剂苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉等在豇豆生长过程中需多次重复使用。导致豇豆中农药残留超标的风险很大，豇豆质量安全受到威胁。因此，建立简单、快速、监测项目范围广的农药残留分析技术已成为近年来农残检测的一个发展方向和研究热点[25]。

利用超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS） 同时测定豇豆生产中常用杀虫剂与杀菌剂等残留的报道还很少，虽然有关啶虫脒、阿维菌素、氟啶虫胺腈的检测方法相对多样，如气相色谱法、液相色谱法和液相色谱串联质谱等，但存在前处理步骤繁琐的弊端[69]。吴宇宽等[10]采用高效液相色谱-加热电喷雾串联质谱法建立了同时测定蔬菜、水果中阿维菌素和甲维盐的方法。章虎等[11]采用液相色谱法建立了同时测定稻米中阿维菌素和甲维盐残留的方法。本研究采用UPLCMS/MS方法，首次进行豇豆上8种常用农药的最终残留研究，为检测豇豆中8种农药残留量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豇豆样品：分别于2016年12月26日、2017年1月26日、2017年2月26日在海南省三亚市崖城镇拱北村豇豆种植基地进行采样，3个批次共15个豇豆样品（其中5个前期采摘样品、5个中期采摘样品、5个后期采摘样品），分别匀浆混匀，-20℃冰箱冷冻保存待测。

标准品：啶虫脒（acetamiprid）、阿维菌素（abamectin）、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（emamectin benzoate）、氟啶虫胺腈（sulfoxaflor）、灭蝇胺（cyromazine）、苯醚甲环唑（difenoconazole）、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和烯酰吗啉（dimethomorph）均购自上海安谱科学仪器有限公司。乙腈，美国Fisher公司；甲醇（HPLC级），美国Fisher公司；超纯水和甲酸，美国SigmaAldrich公司。其余试剂均为国产市售分析纯。

1.2 主要仪器设备

HClass超高效液相色谱仪（美国WatersAcquity公司）、 AB SCIEX API4000+三重四级杆质谱仪（美国AB SCIEX公司）、配电喷雾离子源（ESI） 与 EB28012电子天平（日本岛津公司）、SB400 DTY 超聲波扫频清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、Anke TDL40B离心机（上海安亭科学仪器厂）、QL901旋涡混合器（江苏海门其林医用仪器厂）、MilliQ 超纯水仪（美国Millipore公司）、0.22 μm有机系滤膜（天津美瑞泰克公司）、超低温冰箱（美国Kaltis公司）。

1.3 样品前处理

称取20 g已匀浆样品于50 mL烧杯中，加入40 mL乙腈，匀浆2 min。倒入装有5～7 g氯化钠的具塞量筒中，振摇2 min， 静置30 min。取1 mL上清液于2 mL离心管中，加入稀释液（甲醇∶水=1∶1）1 mL，涡旋1 min，过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 基质匹配标准溶液的配制

取豇豆空白样品，按1.3节的方法处理，用上清液分别溶解8种农药标准品，配制成各农药质量浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2和1.0 μg/mL的混合标准溶液，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜，待测。

1.5 检测条件

色谱条件：ACQUITY_UPLCTMBEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温35℃；进样量5 μL； 流速0. 25 mL/min； 运行时间10 min。梯度洗脱条件见表1。在此条件下8种农药的保留时间见表2。

质谱条件：离子源为ESI（+）；正离子扫描模式；毛细管电压： 2 800 V；离子源温度：110℃；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流量：900 L/h；锥孔反吹气流量：50 L/h；碰撞气流速度：0.21 mL/min；多反应监测扫描模式（MRM）。多反应监测（MRM）分析的质谱参数见表2。

1.6 定量方法

在正离子模式测定条件下，分别将豇豆样品溶液和基质匹配混合标准溶液注入液相色谱串联四极杆质谱仪进行测定。采用外标法定量，以定性离子对为依据进行定性，以定量离子对的峰面积计算样品中待测物的含量。

1.7 标准曲线的绘制和添加回收试验

取1.4节配制的混合标准溶液，按1.5节的条件测定。以标准溶液的质量浓度（x）为横坐标，以监测离子峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线。向豇豆空白样品中添加0.01、0.1和1 μg/mL的3个水平的8种农药混合标准溶液，按照1.3节的前处理方法和1.5节的条件测定，每个水平重复5次，计算添加回收率和相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

本试验以乙腈为提取溶剂。采用QuEChERS净化方法，简单易行。与传统的前处理方法比，QuEChERS方法省去了过柱、旋蒸和定容步骤，减少提取过程中农药残留量的损失，检测结果更能反映真实值。

2.2 质谱条件选择

采用1 mg/kg浓度的8种农药标准溶液单针进样，优化质谱条件。通过一级质谱后，产生稳定的[M+H]离子。确定母离子后，在SIM模式下优化各目标化合物的碎裂电压。母离子进入二级质谱，产生不同的离子碎片。在子离子扫描模式下，优化碰撞能量，得到相应的离子碎片。用于母离子定性和定量的优化；优化碰撞能量，使这2个特征碎片离子的响应最大，最后得到8种化合物相应的MRM离子对以及质谱参数。

2.3 色谱条件选择

当流动相中的水相为超纯水时，质谱对检测化合物的灵敏度较低。向水相中加入1.0 mmol的乙酸铵溶液则可以极大地提高灵敏度。通过试验最终确定流动相为甲醇和1.0 mmol的乙酸铵溶液，可以同时满足8种农药的灵敏度和较好的峰形要求。

2.4 线性检验

8种农药在0.01～1 μg/mL添加浓度范围内，色谱峰面积与浓度均呈线性相关，回归方程及相关系数见表3，说明此方法可以用于豇豆中8种农药的定性定量分析，8种农药混合标准溶液的MRM色谱图见图1。

2.5 检出限、添加回收率和变异系数

根据空白样品的基线噪声值求其平均值， 得到样品中啶虫脒、阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟啶虫胺腈、灭蝇胺、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和烯酰吗啉的检出限分别为0.36、0.50、0.08、1.8、1.81、1、1、0.09 μg/kg。准确性以添加回收率表示，精密度以同批次样品回收率的变异系数表示。3组添加水平8种农药的添加回收率和变异系数结果见表4。

2.6 实际样品检测结果

检测结果表明， 5个前期样品检测出氟啶虫胺腈、灭蝇胺、啶虫脒、阿维菌素、烯酰吗啉；5个中期样品检测出灭蝇胺、啶虫脒、烯酰吗啉；5个后期样品检测出灭蝇胺和啶虫脒。检出量见表5，其他3種农药均未检出。MRM色谱图见图2。

3 结论与讨论

本试验采用改进的QuEChERS方法提取和净化样品，利用UPLCMS/MS快速检测豇豆中8种农药残留，其色谱峰分离效果好，操作简单，检出限0.08～1.81 μg/kg，定量限为0.024～0.603 μg/kg，且在10 min内即可完成8种农药多残留分析。该方法平均回收率均在90%以上，相对标准偏差不大于10%，完全符合农药残留分析的要求。此外，该方法与现有的国家标准和文献相比，在实际应用中效果更好，更适合大量豇豆样品的检测。

参考文献

[1] 王爽，许如意，刘勇，等. 海南豇豆主要病虫害的发生及防治技术[J]. 长江蔬菜，2016（19）：5154.

[2] CUNHA S C， LEHOTAY S J， MASTOVSKA K， et al. Evaluation of the QuEChERS sample preparation approach for the analysis of pesticide residues in olives [J]. Journal of Separation Science， 2007， 30（4）：620.

[3] XU R， WU J， LIU Y， et al. Analysis of pesticide residues using the quick easy cheap effective rugged and safe （QuEChERS） pesticide multiresidue method in traditional Chinese medicine by gas chromatography with electron capture detection[J]. Chemosphere， 2011， 84（7）：908912.

[4] JIAN W， XU R， ZHAO R H， et al. Analysis of pesticide residues using the quick easy cheap effective rugged and safe（QuEChERS） pesticide multiresidue method in fifty traditional chinese medicine by gas chromatography [J]. Journal of Analytical Science， 2011， 27（2）：167170.

[5] PAY P， ANASTASSIADES M， MACK D， et al. Analysis of pesticide residues using the quick easy cheap effective rugged and safe （QuEChERS） pesticide multiresidue method in combination with gas and liquid chromatography and tandem mass spectrometric detection [J].Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2007， 389（6）：16971714.

[6] 崔淑华，李正义，程刚，等. 超高效液相色谱串联质谱法测定果蔬中氟啶虫胺腈、pyrifluquinazon和螺虫乙酯残留量[J]. 食品科学，2017.（20170426）[20170811]. http：∥kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20170426.1459.010.html.

[7] 路海燕，李斌，陈忠正，等.分散固相萃取HPLC检测绿茶茶汤中吡虫啉和啶虫脒残留[J]. 食品科学，2013（20）：203206.

[8] 何红梅，赵华，张春荣，等. 超高效液相色谱串联质谱法测定水稻基质中阿维菌素残留量[J]. 分析化学，2012（1）：140144.

[9] 李慧冬，杜红霞，陈子雷，等.气相色谱法测定甘蓝中啶虫脒残留量[J]. 化学分析计量，2006（6）：2223.

[10]吴宇宽，赵静，高进，等.高效液相色谱串联质谱法检测蔬菜、水果中阿维菌素、甲维盐残留[J]. 湖北大学学报（自然科学版），2013（4）：461464.

[11]章虎，钱鸣蓉，董程，等.液相色谱法同时测定稻米中阿维菌素和甲维盐残留[J]. 浙江农业科学，2010（6）：13581361.

（责任编辑：杨明丽）