小RNA深度测序鉴定昭通市烟草脉斑病病毒

陶永萍 尹跃艳 陈旭 卢训 李婷婷 赵声春 游堂贵 丁铭

摘要 烟草脉斑病在云南昭通市的烟草上发生危害严重，为明确昭通市烟草脉斑病的病毒种类，本研究采集昭通市的4个烟草种植区症状表现为疑似烟草脉斑病的烟草样品，采用小RNA深度测序技术对不同来源的混合样品进行小RNA测序分析。结果显示混合样品中的病毒分别属于烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus。根据不同病毒属设计通用引物，分别对不同地区的烟草样品进行RT-PCR验证，结果表明，烟草样品中病毒种类有烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒、烟草脉扭病毒和马铃薯Y病毒的PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN株系。

关键词 烟草脉斑病； 烟草病毒； 小RNA深度测序

中图分类号： S 432.41

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017211

Abstract Flue-cured tobacco vein spot disease causes severe damage to tobacco production in Zhaotong City， Yunnan Province of China. In this study， siRNA deep sequencing was used to analyze the viruses in tobacco samples with necrotic and mosaic symptoms on tobacco leaves. The samples were collected from four different areas in Zhaotong City and mixed into one sample for siRNA sequencing analysis. The results showed that the identified viruses belonged to three genera， including Tobamovirus， Potyvirus and Polerovirus. RT-PCR and sequencing were used to identify the species of the viruses. Four viruses were detected in the samples， including TMV， TVBMV， TVDV and three strains of PVY （PVYN， PVYN-Wi， PVYNTN）.

Key words tobacco vein spot disease； tobacco virus； siRNA sequencing

烟草是云南省的重要农业产业，在全省范围内常年种植面积保持在35万hm2左右。由于烟草病毒病害常年发生，加之寄主植物和传毒介体周年分布，导致了病毒病原大量积累，烟草病毒病发生危害日益严重。烟草脉斑病在云南昭通烟区发生危害较为普遍，该病自2007年在昭通市小面积发生，2008年发病面积及危害程度大幅增加，目前已成为影响该地区烟草生产最重要的病害之一。烟草脉斑病最早在山东、辽宁、安徽北部和河南西部等地发生危害严重，发病率高达 50%～80%，部分田块甚至绝收[14]。该病主要由马铃薯Y病毒Potato virus Y（PVY）侵染引起，常與黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus（CMV）、烟草蚀纹病毒Tobacco etch virus（TEV）、烟草脉斑驳病毒Tobacco vein mottle virus（TVMV） 、烟草坏死病毒Tobacco necrosis virus（TNV）等病毒中的1个或多个复合侵染烟株[5]。由于该病主要由PVY引起，其症状与病毒种类具有密切的关系，根据侵染烟草的PVY株系可大致将症状分为花叶、脉坏死、条斑及茎坏死[1]。

通过前期调查发现，烟草脉斑病样品中存在多种病毒复合侵染的现象，且在不同地区的复合侵染类型不同，采用传统的血清学、PCR等方法对症状表现明显的烟草病毒病原进行鉴定不能完整地反映样品中的病毒种类，尤其不能检测到可能存在的不同病毒病原。利用基于小RNA深度测序的病毒鉴定技术，不仅能检测到寄主中不同病毒病原，同时具有更高的灵敏度和信噪比。因此本研究在昭通烟区4个不同烟草脉斑病重病区采集典型症状样品，采用小RNA深度测序技术对烟草脉斑病病样进行检测和分析，为病害的防控提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

烟草样品采自云南省昭通市苏家院、布嘎、北闸、守望等4个病毒病发生较重的烟区，样品症状主要表现为脉坏死、植株矮化、叶片坏死斑点并伴随有顶部花叶症状，同时提取不同采集地点的烟草样品RNA用于测序结果的验证分析。

1.2 方法

1.2.1 小RNA测序与分析

将4个地点采集的烟草样品按相同质量比例进行混合，混合样品送于华大基因公司进行小RNA测序分析。提取样品总RNA，测定总RNA的浓度及纯度，将质量合格的RNA样品使用NEB针对Illumina测序平台研发的Small RNA建库试剂盒（NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina）及配套的试剂进行小RNA文库构建。文库构建完成后，使用Agilent2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Qubit2.0和荧光定量PCR对文库的浓度进行定量，以保证文库质量。对检测合格的小RNA文库在Hiseq 2000测序平台进行测序。使用CLC Genomics Workbench 5软件对获得的小RNA序列数据进行组装和比对分析。

1.2.2 小RNA测序结果验证

根据小RNA测序结果与GenBank中序列比对分析结果，设计合成用于检测烟草脉带花叶病毒Tobacco vein banding mosaic virus（TVBMV）的特异性引物TVBMV-8059F/TVBMV-9382R。根据文献报道分别合成用于扩增烟草花叶病毒属Tobamovirus[6]和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus[7]的通用引物，以及辣椒环斑病毒Chilli ringspot virus（ChiRSV）特异性引物[8]，以及用于鉴定PVY不同株系的引物对小RNA测序结果进行验证[9]（表1）。

采用Promega公司的Access RT-PCR System 一步法试剂盒进行反转录和PCR扩增，反应体系为50 μL，其中AMV/Tfl 5×Reaction Buffer 10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游和下游引物各5 μL，25 mmol/L MgSO4 2 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，Tfl DNA Polymerase 1 μL，总RNA 1 μg，补加RNA free水至50 μL。反应条件为45℃反转录45 min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，根据不同引物设定退火温度1 min，68℃延伸2 min，40个循环；68℃延伸7 min。將RT-PCR扩增产物回收并克隆到pEGM-T easy载体上，筛选阳性克隆进行测序。利用DNAMAN Version 7.0进行序列拼接及分析。进化树构建采用了MEGA 6.0软件[10]，以NJ（neighbor-joining）方法构建，进化树各分支的可信度用Bootstrap检测（1 000次重复）。

2 结果与分析

2.1 小RNA测序结果

测序结果显示样品中小RNA序列有35 094 242条，分别与GenBank中报道的序列进行对比，结果表明得到的小RNA序列与13种植物病毒核苷酸相似性较高，在93%～100%之间。这13种植物病毒分属烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus，烟草花叶病毒属包括烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus （TMV）、番茄花叶病毒Tomato mosaic virus （ToMV）、辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus （PMMV）、地黄花叶病毒Rehmannia mosaic virus （ReMV）；马铃薯Y病毒属包括马铃薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、烟草脉带花叶病毒Tobacco vein banding mosaic virus （TVBMV）、辣椒环斑病毒Chilli ringspot virus（ChiRSV），其中PVY还有PVYO、PVYN、PVYNTN、PVYN-Wi 4个株系；黄症病毒科的马铃薯卷叶病毒属包括甜菜轻型黄化病毒Beet mild yellowing virus （BMYV）、甜菜黄萎病毒Beet chlorosis virus （BChV）、甜菜西黄病毒Beet western yellows virus （BWYV）、芸薹属植物黄化病毒Brassica yellows virus （BrYV）、芜菁黄化病毒Turnip yellows virus （TuYV）、烟草脉扭病毒Tobacco vein distorting virus （TVDV）（表2）。

2.2 烟草花叶病毒属病毒验证

根据张永江等[6]的报道，应用引物Tobamo6F6和Tobamo6R6对样品进行PT-PCR扩增，得到约0.25 kb大小的目的条带（图1a），回收目的条带进行克隆，挑取5个克隆进行测序分析。测序结果表明扩增片段大小为0.2 kb，经Blast比对分析与TMV核苷酸序列相似性最高，与已报道的四川徐永分离物（No.HE818454）相似性为100%。构建该序列与TMV不同病毒分离物的系统进化树，结果显示昭通烟草上TMV与四川叙永分离物（No.HE818454）关系最近，与云南鲁甸分离物关系次之（图2a）。结果表明，小RNA深度测序检测到的烟草花叶病毒属病毒为TMV。用于构建系统进化树的序列来自GenBank，序列号分别为：TMV烟草分离物（No.HE818435， HE818454），ToMV番茄分离物（No.FN985165），ToMV人参果分离物（No.KJ207374），辣椒轻斑驳病毒益母草分离物（No.KR108207），辣椒轻斑驳病毒甜椒分离物（No.KP345899），地黄花叶病毒地黄分离物（No.EF375551， JX575184）。

2.3 马铃薯Y病毒属病毒验证

用TVBMV特异性引物（TVBMV-9382R/TVBMV-8059F）和ChiRSV特异性引物（ChiRSV1f/ChiRSV 1r）验证样品中是否带有TVBMV和ChiRSV。结果显示，前者扩增得到约1.2 kb的目的条带，而后者未扩增到目的条带（图1b、c）。回收该目的片段进行克隆和测序，测序结果表明目的片段大小为1.324 kb，与TVBMV YN9.1分离物（No.KF444434）的核苷酸相似性为99%。结果表明小RNA测序结果中的马铃薯Y病毒属病毒为TVBMV。

2.4 马铃薯Y病毒不同株系验证

根据Rigotti和Gugerli[9]的报道，应用3对引物PVYc3/PVYf，PVY3+/PVY3-，CP2+/CP1-，严格按照报道中所述的引物浓度比例，采用Access RT-PCR System反应条件及体系进行反转录和PCR扩增，分别得到约1.1、0.51 kb及0.48 kb的条带（图1e），回收各条带进行克隆和测序。测序结果显示，片段大小为1.114 kb的目的条带与已报道的新西兰分离物（No.AM268435）相似性为98%，为PVYN株系的部分序列。片段大小为0.532 kb的目的片段与已报道的南非TT138E-102-96分离物（No.GQ853641）序列相似性为99%，为PVYN-Wi株系的外壳蛋白碱基序列。片段大小为0.438 kb的目的条带与已报道的中国HN2分离物（No.GQ200836）相似性为99%，为马铃薯Y病毒全基因的部分序列。根据Hu[7]等对HN2分离物的报道，HN2分离物占有PVYO血清型，致病型表现多样，在烟草上表现为PVYN，在马铃薯上表现为PVYNTN型。

根据报道，引物CP2+/CP1-特异性检测PVYN-Wi株系，因此判断供试样品中存在PVYN-Wi株系。引物PVYc3和PVYf檢测PVYN、PVYNTN、PVYO及PVYC 株系， PVYO和PVYC应扩增出0.66 kb片段，PVYN和PVYNTN应扩增出0.44 kb片段，结合株系验证结果，供试样品扩增出的条带大小为0.438 bp，表明为重组PVYNTN 株系，因此判断供试样品中存在重组PVYNTN株系，没有PVYO和PVYC 株系。引物PVY3+和PVY3-能检测PVYN和非重组PVYNTN株系，结合株系验证结果，供试样品扩增出的条带大小为1.114 kb，表明为重组PVYN 株系，因此判断供试样品中存在重组PVYN株系。综上所述，供试样品中存在PVYN-Wi、重组PVYNTN和PVYN 株系。

2.5 马铃薯卷叶病毒属病毒验证

用黄症病毒科通用引物Lu1和Lu4[7]，进行反转录和PCR扩增，在约0.8、0.7 kb和0.650 kb处各有一条明显的条带（图1d），回收各条带进行克隆和测序。测序结果表明0.8 kb条带为烟草线粒体基因组DNA碱基序列；0.7 kb条带为TVDV 核苷酸序列，具体为0.572 kb，与已报道的云南龙陵分离物（No.EF529624）序列相似性为100%；0.65 kb条带也为TVDV 核苷酸序列，具体为0.54 kb，与已报道的云南保山分离物（No.AF402621）序列相似性为99%，结果显示烟草样品中的马铃薯卷叶病毒属病毒是TVDV。用0.572 kb条带和0.54 kb条带序列与GenBank中的相关序列构建进化树（见图1b），与云南的所有分离物都聚在一起。用于构建系统进化树的序列来自GenBank，病毒名称及序列号分别为：BMYV（No.EF107543），BChV（No.EU022510），BWYV（No.X13062），BrYV（No.KP178197），TuYV（No.KR706247）TVDV（No.EF529624，KP772232，KP772233）。

3 讨论

云南地处我国西南边陲，西部与缅甸唇齿相依，南部和东南部分别与老挝、越南接壤。该区域地处低纬高原，地理位置特殊，地形地貌复杂。全省气候类型丰富多样，有热带、亚热带、中温带和高原气候类型，其气候类型的多样化，造就了繁多的生物种类。云南烟草病毒种类多样，目前已报道的病毒种类多达30多种，其中TMV[11]、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus （CMV）[12]、TVBMV[13]、番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt virus （TSWV）[14]、双生病毒begomoviruses[15]、PVY[16]、烟草丛顶病毒Tobacco bushy top virus （TBTV）[17]是长期、多区域危害云南省烟草并造成重大损失的病毒病原。

2007-2017年对昭通烟区烟草病害调查及病原检测研究表明，云南昭通地区烟草受马铃薯Y病毒属病毒的危害严重，发病率在3%～10%之间，重病区发病率可以达到100%，严重影响了该地区烟草产量和质量。前期对该病害病原的鉴定采用的是传统的血清学检测及RT-PCR鉴定的方法，因此大部分研究结果仅局限在potyviruses的研究[5，17]。本研究的小RNA深度测序结果表明烟草样品中小RNA序列与13种植物病毒相似性较高（93%～100%），这13种植物病毒分别属于烟草花叶病毒属、马铃薯Y病毒属和马铃薯卷叶病毒属等3个病毒属。烟草花叶病毒属包括TMV、ToMV、PMMV、ReMV；马铃薯Y病毒属包括PVY、TVBMV、ChiRSV，其中PVY还有PVYO、PVYN、PVYNTN、PVYN-Wi 4个株系；马铃薯卷叶病毒属包括BMYV、BChV、BWYV、BrYV、TuYV、TVDV。由于小RNA测序所得序列较短，在GenBank中进行序列对比时，如果某一段病毒序列是该病毒所在属内病毒的保守序列，就可能将同属不同种病毒都作为结果统计出来，而实际上样品中没有那么多病毒。因此我们用RT-PCR对4个属的13种病毒进行验证，且对PVY 株系也进行了验证。结果证明昭通烟区症状表现为脉坏死、植株矮化、叶片坏死斑点并伴随有顶部花叶症状烟草样品中病毒种类有4种，分别为TMV、TVDV、TVBMV和PVY，其中PVY包含不同株系，分别是PVYN-Wi、重组PVYNTN和PVYN 株系。根据前期研究结果，昭通烟区烟草脉斑病的主要病毒为PVY，且有不同株系的PVY复合侵染烟草，本结果与前期检测结果相同[17]。

TVDV是引起烟草丛顶病的两种病毒之一，在发病烟草中多与烟草斑驳病毒Tobacco mottle virus （TBMV）复合侵染烟草引起烟草丛枝病，自然条件及人工接种都很难得到单独感染TVDV的烟草植株[18]。本研究通过小RNA深度测序检测到昭通烟草脉斑病样品中有TVDV的侵染，但未检测到TBMV，且发病烟草田块中也未发现有疑似丛顶病症状的烟草，这是云南首次报道TVDV与其他病毒复合侵染烟草，而对于TVDV在烟草脉斑病病害流行过程中扮演的角色还有待进一步研究。

TVBMV为马铃薯Y病毒科Potyviridae马铃薯Y病毒属Potyvirus病毒。2004-2006年Tian对中国四大烟草主产区的烟草病毒病进行调查，首次发现云南烟草中TVBMV的存在[19]。前期研究也发现TVBMV是烟草脉斑病的主要病毒之一，本研究中小RNA深度测序结果也证明了TVBMV是该烟区的优势病毒。

本研究中报道的4种病毒，除TMV以外均为蚜虫传播的病毒。在昭通烟区，烟草通常与马铃薯、辣椒种植田块相邻，在日常施用化学杀虫剂进行蚜虫防治时，防虫效果不理想，主要原因在于不同作物间不能统防统治，加之该地区马铃薯种薯质量参差不齐，因此该地区烟草脉斑病发病率和危害程度持续较高，病害防控效果不显著。针对以上情况，对该区域蚜虫病毒病害的防控要从“大农业”角度，实行统防统治；种植优质无毒种薯；以治虫防病为主，建立一个健康、少毒源的环境才能有效控制病害的持续危害。同时加强对不同时期的烟草植株、周边寄主植物的病毒和介体昆虫的监测，保持农田环境“洁净”，防止大规模病毒再侵染和病害的暴发流行。

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（责任编辑：田 喆）