基于SELDI—TOF—MS的冷却滩羊肉微生物差异蛋白分析

摘 要：以托盘密封包装的冷鲜滩羊肉为研究对象，基于组合蛋白芯片与表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）平台对滩羊肉表面微生物蛋白进行分析，区分不同贮藏时间生物样本之间的差异。通过正交矫正偏最小二乘法判别分析判断模型第一主成分的得分值（VIP阈值>1），并结合学生氏t检验的P值（阈值<0.05）寻找差异性表达蛋白。结果表明：应用Biomarker Wizard软件分析找出差异蛋白峰132 个，其中75 个差异蛋白峰可根据质荷比经Swiss-Prot数据库检索出对应的蛋白质，其余57 个差异蛋白峰对应的为未知蛋白；从上述差异蛋白中未找到酶类的差异蛋白，但是找到了可能和滩羊肉菌体有关联的19 个菌体蛋白。SELDI-TOF-MS技术能够用于检测冷鲜滩羊肉不同贮藏阶段基因表达的各种蛋白质，从而发现大量具有价值的蛋白质标志分子。

关键词：滩羊肉；微生物；表面增强激光解吸电离飞行时间质谱；差异蛋白

Abstract： Microbial proteins on the surface of tray-packaged chilled Tan sheep meat were analyzed by surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （SELDI-TOF-MS） and biological samples collected at different times during chilled storage were differentiated. The variable importance in the projection （VIP） value （threshold > 1） of the first principal component of the orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA） model was determined and combined with the P value （threshold < 0.05） of students t test to find out the differentially expressed proteins. The results showed that 132 differential protein peaks were obtained by Biomarker Wizard software， 75 of which were identified by searching in the Swiss-Prot database based on their mass-to-charge ratio， and the remaining 57 were unknown proteins. These differential proteins did not include enzymes but included 19 proteins that might associated with bacteria on mutton meat. In summary， SELDI-TOF-MS allows the detection of various differentially expressed microbial proteins at different storage times of chilled Tan sheep meat and consequently the identification of a large number of valuable protein markers.

Keywords： chilled Tan sheep meat； microorganism； surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （SELDI-TOF-MS）； differential protein

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802006

中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）02-0033-07

引文格式：

胡倩倩， 杨波， 罗瑞明， 等. 基于SELDI-TOF-MS的冷却滩羊肉微生物差异蛋白分析[J]. 肉类研究， 2018， 32（2）： 33-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802006. http：//www.rlyj.pub

HU Qianqian， YANG Bo， LUO Ruiming， et al. Surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry analysis of surface microbial differential proteins in chilled tan sheep meat[J]. Meat Research， 2018， 32（2）： 33-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802006. http：//www.rlyj.pub

寧夏盐池滩羊是经长期自然选择和人工选育而成的裘肉兼用型品种，被农业部列为国家二级保护品种。滩羊肉脂肪分布均匀、膻味较轻、肉质细嫩鲜美、营养丰富、风味独特，深受广大消费者的喜爱[1-3]。冷鲜滩羊肉是指对严格按照检疫制度屠宰后的胴体迅速进行冷却处理，使胴体温度（以后腿为测量点）在24 h内降为0～4 ℃，并在后续的流通过程中始终保持在0～4 ℃范围内的鲜羊肉[4-8]。

随着我国人民生活水平的提高，冷鲜肉正逐渐成为我国肉类消费的主流，在冷鲜肉的推广过程中，微生物对于货架期的影响是最大问题之一，只有保证食品的质量安全，冷鲜肉才能快速、稳定地进一步发展[9-10]。作为生物信息表达的终端层次，蛋白质在基因功能诠释和转录状态分析等方面显现出很大的潜力。而蛋白质组学作为一种系统生物学研究中十分有力的分析技术，能从整体角度出发，对生物体的研究更加多项化。蛋白质组由基因组表达，受到环境条件和处理条件的影响，可以看作是基因组和肉的功能品质之间的分子连接[11-14]。蛋白质组学可以解释不同遗传背景或不同肉处理方法影响肉质的分子机制[15-16]。蛋白质组学的高度发展已经使其在生命科学领域得到了广泛应用，也是解决食品安全相关品质以及食品科学问题的有效性工作，给食品科学领域提供了更为广泛的思路和技术，这些技术在食品安全领域也被更加广泛地应用[17-20]。近几年兴起的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）[21-22]技術为蛋白质组学研究提供了一个理想平台，是一项极有应用前景的技术，将会大大改变目前一些疾病诊断落后的状况[23-24]。质谱技术是蛋白质鉴定技术的核心，它是一种超微、高通量、全自动筛选蛋白技术，可以检测各种样品，包括血清、尿液和细胞等[25-27]。SELDI-TOF-MS技术尚未应用于肉类，参数有待进一步完善，以便使其继续在肉品等食品中的应用得到推广。

本研究以密封托盘包装冷鲜滩羊肉为研究对象，采用SELDI-TOF-MS技术区分不同贮藏时间冷鲜滩羊肉生物样本之间的差异，进而寻找造成异同的变量或分子，即差异蛋白。张赫宇等[28]采用宏基因组分析了宁夏冷却滩羊肉的初始菌相，指出该地区冷却滩羊肉中的主要腐败菌为假单胞菌、乳酸菌、肠杆菌科及葡糖球菌。差异蛋白的寻找能够为揭示冷鲜肉微生物差异蛋白与样本的关联性及冷鲜滩羊肉微生物的代谢驱动研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滩羊后腿肉购自宁夏大夏牧场清真食品有限公司，滩羊饲养期间不做任何生物性防疫，且定期进行清粪、消毒处理。

乙腈（色谱纯）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，色谱纯）、无水醋酸钠（NaAc，分析纯）、3-[3-（胆酰氨丙基）二甲铵基]丙磺酸内盐（3-[（3-cholamidopropyl）dimethylammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS，色谱纯）、三羟甲基氨基甲烷（Tris碱，色谱纯）、盐酸（HCl，分析纯）、尿素（Urea，色谱纯）、双[3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基]胺（bis[3-（triethoxysilyl）propyl]amine，SPA，色谱纯）、氯化钠（NaCl，分析纯）、氢氧化钠（NaOH，分析纯）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES，色谱纯）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT，色谱纯）、U9裂解液（5 mL 9 mol/L Urea、2% CHAPS、50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0）、WCX-2缓冲液（50 mmol/L NaAc，pH 4.0） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

PBSIIC型蛋白质芯片飞行时间质谱仪 美国赛弗吉公司；LDZ5-2型低速自动平衡离心机 北京医用离心

机厂；MDF-382型冰箱（-80 ℃） 日本三洋公司；MS1 Minishaker型振荡器 广州仪科实验室技术有限公司；

PB20型pH测量仪 德国赛多利斯公司；ER-182A型电子天平 日本爱安德公司；微量加样枪（2、10、20、100、200、1 000 μL） 吉而逊实验仪器（上海）有限公司；Tips P20、P200、P1000离心管（50 mL）、微形离心管（0.5 mL、1.5 mL） 美国康宁公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

当天屠宰的滩羊后腿肉立刻放入干冰中贮存，返回实验室后迅速放入-20 ℃冰箱放置1 h，使肉的中心温度降为0 ℃。在无菌条件下，采集0 ℃条件下贮藏的滩羊肉表面刮擦物100 mg（含微生物、血液、肉汁液等），封装于灭菌冷冻管中待用。采样时间点分别为0、4、8、12 d，每组样本做5 个平行[29]。

1.3.2 样品预处理

1.3.2.1 细胞淬灭

采用低温冻结细胞内酶活力的液氮淬灭法对采集的样本进行淬灭，冰上解冻后收集菌体。冷冻时间为分别静置1、2、3、4、5 min[30]。

1.3.2.2 菌体分离

将细胞淬灭物在-9 ℃、12 000 r/min条件下冷冻离心3 min，弃上清并用0 ℃的预冷去离子水洗涤菌体，重复3 次，得到的菌体冻存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 上机检测

从-80 ℃冰箱中取出菌液，置于冰盒上融解。准备2 组EP管，取配制好的U9裂解液20 μL加入到500 μL的EP管内；再取菌液10 μL加入EP管中，充分混匀；室温下静置30 min；向变性后的菌液标本中加入370 μL WCX-2缓冲液，尽快混匀；吹打血清样品（避免产生气泡）。样品处理完毕后静置备用，待上机检测。

1.3.4 数据预处理

用Ciphergen Protein Chip 3.2.1软件（美国Ciphergen公司）收集数据。数据处理方法参照周继红[31]的方法，并略作改动。原始数据经Ciphergen Protein Chip 3.2.1软件进行校正处理，得到峰值数据，质荷比小于1 000的峰值多为基质峰，信噪比宽松到3，过滤后在此基础上进行后续的数据分析。

1.3.5 数据处理

使用Ciphergen Protein Chip 3.2.1软件自带的Biomarker Wizard 5.0软件筛选差异峰，比较不同组样品间的差异。将2 组样品的峰值做Wilcoxon秩和检验，用计算出的P值判断峰值是否有显著差异（P=0.05）。采用t检验统计学方法对数据进行分析，进一步采用SPSS 12.0软件中的ROC（receiver operating characteristic）曲线分析差异蛋白，α=0.05。

2 结果与分析

2.1 滩羊肉微生物差异峰筛选

比较各组样品的差异峰筛选结果，以0.05作为P值的阈值，筛选差异峰。由表1～3可知，所筛选的差异峰结果有益于接下来差异蛋白的建模。

2.2 滩羊肉微生物层次聚类分析

2.3 滩羊肉微生物的多元变量分析

应用主成分分析（principal component analysis，PCA）对贮藏0～4、4～8、8～12 d的冷鲜滩羊后腿肉表面刮擦物的SELDI-TOF-MS结果进行分析。使用SIMCA软件（V14，Umetrics AB，Umea，Sweden）對模型进行正交矫正偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），最大化地凸显模型内部与预测主成分相关的差异。OPLS-DA首先进行UV格式化处理的数据标度换算，接着对第一、第二主成分进行建模分析。模型的质量用7 折交叉验证进行检验，并用交叉验证后得到Y变量的可解释性和模型的可预测性对模型的有效性进行评判。然后，通过排列实验随机多次（n=200）改变分类变量Y的排列顺序，得到相应不同的随机预测值，对模型有效性进行进一步检验。

模型的可预测性越接近1，说明OPLS-DA模型越能很好地解释2 组样本之间的差异。由表4可知，3 组滩羊肉微生物间的差异很明显。

由图4～6可知，OPLS-DA得分图表明贮藏0～4、4～8、8～12 d的冷鲜滩羊肉能够完全区分，但贮藏0～4 d组和贮藏8～12 d组内呈一定的发散分布，这表明2 组冷鲜滩羊肉的组内差异蛋白存在明显差异。3 组模型的可解释变量R2X分别为0.705、0.770和0.733；3 组监督模型的解释率R2Y分别为0.977、0.992和0.989；3 组模型的可预测度Q2分别为0.931、0.959和0.936，这说明该模型有很好的预测性。3 组样品的置换检验图截距R2分别为0.409、0.742和0.715；Q2分别为-0.882、-0.617和

-0.645，说明置换检验图可以很好地体现模型的稳健性。3 组样品的载荷图左右两端物质为潜在差异标志物，图中三角代表2 组虚拟的Y值，距离三角越近的X变量对应的蛋白质具有更好地区分2 组样品的能力。因此，构建的OPLS-DA模型能够很好地区分3 组样品的差异蛋白质。

2.4 滩羊肉微生物差异蛋白的预测

以Swiss-Prot数据库中的蛋白质数据为标准，利用自有代码编写的软件将SELDI数据与蛋白质的氨基酸分子质量进行比较，找到最为相似的蛋白质作为预测结果。不同贮藏时间滩羊肉微生物差异蛋白的详细预测信息如表5～7所示。未检索出的其他蛋白质可能为未知蛋白质。

从上述差异蛋白中找到了可能和滩羊肉菌体有关联的19 个菌体蛋白，分别为ATP合成蛋白、生长调节α蛋白、坏死诱导疫霉蛋白、还原型辅酶Ⅰ-泛醌氧化还原酶链4L、生长抑制素-28、生长激素释放素、60S核糖体蛋白L40、角蛋白关联蛋白8-1、抗菌肽、ATP合酶F（0）复合体亚基C1、编码载脂蛋白、朊蛋白类、角蛋白关联蛋白3-1、硫氧还蛋白、β2-微球蛋白、巨噬细胞移动抑制因子、40S核糖体蛋白S26、载脂蛋白E、磷脂结合蛋白。

3 结 论

以滩羊肉表面刮擦物为研究对象，应用组合蛋白芯片与SELDI-TOF-MS技术对不同贮藏时间滩羊肉表面的刮擦物微生物进行分析。在整个数据预处理过程中分析数据，数据分析包括差异峰筛选、层次聚类分析、PCA、OPLS-DA模型构建、差异峰对应蛋白预测。共预测差异蛋白峰132 个，其中75 个可根据质荷比经Swiss-Prot

数据库检索出对应的蛋白质；从上述差异蛋白中找到了可能和滩羊肉菌体有关联的19 个菌体蛋白，分别为ATP合成蛋白、生长调节α蛋白、坏死诱导疫霉蛋白、还原型辅酶Ⅰ-泛醌氧化还原酶链4L、生长抑制素-28、生长激素释放素、60S核糖体蛋白L40、角蛋白关联蛋白8-1、抗菌肽、ATP合酶F（0）复合体亚基C1、编码载脂蛋白、朊蛋白类、角蛋白关联蛋白3-1、硫氧还蛋白、β2-微球蛋白、巨噬细胞移动抑制因子、40S核糖体蛋白S26、载脂蛋白E、磷脂结合蛋白。

差异蛋白的寻找有助于深入探究滩羊肉微生物的代谢过程，因此能够为揭示冷鲜肉微生物差异蛋白与其的关联性提供理论参考，为研究冷鲜滩羊肉微生物的代谢驱动打下基础，揭示微生物群落演替的内在驱动机制，为冷鲜滩羊肉加工技术创新提供参考。

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