珍珠贝外套膜胶原蛋白肽及其锌螯合物的体外抑制骨质疏松作用

摘 要：研究珍珠贝外套膜胶原蛋白肽（pearl oyster mantle collagen peptide，POM-CP）及其锌螯合物（zinc-chelating pearl oyster mantle collagen peptide，POMCP-Zn）对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响。结果表明：噻唑蓝检测结果显示，与空白对照组相比，POMCP-Zn能够显著促进成骨细胞的增殖，而POM-CP对成骨细胞的增殖性无显著影响；与空白对照组相比，400 μg/mL的POM-CP和10 μg/mL的POMCP-Zn将成骨细胞的碱性磷酸酶活性分别提高到1.31 倍和1.48 倍；POMCP-Zn还可以提高成骨细胞分化阶段Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素蛋白的分泌量，同时促进成骨细胞矿化阶段骨结节的形成。综上所述，与POM-CP相比，POMCP-Zn对成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化有较强的促进作用，POMCP-Zn有望成为预防骨质疏松症的潜在功能性食品。

关键词：珍珠贝外套膜；肽锌螯合物；MC3T3-E1细胞；骨质疏松症

Abstract： This study was aimed to investigate the effects of peptides （POM-CP） and zinc-chelating peptides （POMCP-Zn） from pearl oyster mantle collagen on the proliferation and differentiation of the osteoblastic cell line MC3T3-E1. The results of methyl thiazolyl tetrazolium assay （MTT） showed that POMCP-Zn significantly stimulated osteoblastic proliferation in comparison to the control， while POM-CP had no effect on cell proliferation. In addition， POM-CP at 400 μg/mL and POMCP-Zn at 10 μg/mL increased alkaline phosphatase activity 1.31- and 1.48-folds in osteoblastic cells compared with the control. Moreover， POMCP-Zn promoted the production of collagen type I and osteocalcin during osteoblastic differentiation and the formation of bone nodules osteoblastic mineralization. In conclusion， POMCP-Zn exerted a stronger effect than POM-CP on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 and POMCP-Zn is a potential candidate functional factor for osteoporosis prevention.

Keywords： pearl oyster mantle； zinc-chelating peptides； MC3T3-E1 cells； osteoporosis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802002

中图分类号：TS254.9 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）02-0008-07

引文格式：

马婷， 吴谦， 申铉日. 珍珠贝外套膜胶原蛋白肽及其锌螯合物的体外抑制骨质疏松作用[J]. 肉类研究， 2018， 32（2）： 8-14. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802002. http：//www.rlyj.pub

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馬氏珍珠贝（Pinctada martensii）是全球广泛养殖的用于培养海水珍珠最重要的双壳类软体动物之一，在中国、日本和东南亚地区广泛分布[1]。然而随着海水珍珠养殖量的增加，大量的贝肉及珍珠贝外套膜等副产物被丢弃。因此，利用珍珠贝的加工副产物提取胶原蛋白来提高其附加值变得尤为重要。已有文献报道了扇贝胶原蛋白的理化性质及生物学功能。Shen等[2]研究发现，扇贝外套膜胶原蛋白的分子结构、氨基酸含量和肽图谱不同于Ⅰ型胶原蛋白，推测这种扇贝外套膜胶原蛋白为类Ⅴ型胶原蛋白。Mizuta等[3]发现外套膜胶原蛋白含量占干质量的7.7%～12.6%，占总蛋白含量的13.5%～26.5%。胶原蛋白具有广泛的生物活性，与细胞的增殖、分化、黏附和迁移密切相关[4-5]。然而，迄今为止，有关类Ⅴ型胶原蛋白的生物活性却少有报道。

在正常的骨稳态下，成骨细胞向陷窝中分泌类骨质引起的骨形成与破骨细胞的酸化效应、蛋白水解酶引起的骨吸收处于一个动态平衡中[6]。成骨细胞和破骨细胞的相对数量及工作效率共同决定骨量和骨代谢[7-8]。然而，参与骨形成与骨吸收的相关细胞因子会因年龄增长、不良生活习惯、遗传、体质量指数的改变而发生变动，最终使破骨细胞活力大于成骨细胞，进而引发骨质疏松症[9-10]。

据统计，目前中国约有9 000 万人患骨质疏松症，另有2 亿多人骨量低于正常标准，存在患骨质疏松症的风险[11]。

通常，雌激素、降钙素、双膦酸盐和他汀类等藥物是治疗骨质疏松症的首选药物，但长期使用此类药物会引起多种不良反应[12]。因此，当前的首要任务便是寻找一种安全、有效的骨质疏松症治疗方法。

锌是骨骼生长和骨形成中的重要营养因子。有研究表明，锌元素在体内可以增强大腿股骨的骨质量，提高骨硬度和生长板活性，促进成骨细胞的骨形成和矿化[13-15]，

抑制破骨细胞的骨吸收[16-17]，而锌缺乏会抑制细胞外基质的矿化和延迟骨形成[18]。无机锌不稳定、吸收率低，不适合长期摄入，而锌螯合肽可以有效避免上述一系列缺点。与硫酸锌相比，锌螯合肽对矿物质的生物利用率具有更好的作用，它通过载体介导的方式来维持矿物质的可溶性并提高其吸收能力[19]。因此，探讨锌螯合肽对骨质疏松症的治疗效果具有重要意义。

本研究选用珍珠贝外套膜为原料，制备珍珠贝外套膜胶原蛋白肽（pearl oyster mantle collagen peptide，POM-CP）及其锌螯合物（zinc-chelating pearl oyster mantle collagen peptide，POMCP-Zn），探讨POM-CP和POMCP-Zn对MC3T3-E1成骨细胞的增殖和分化的影响，为今后进一步利用水产蛋白资源以及生产治疗骨质疏松症的功能性食品提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马氏珍珠贝由海南泉溢食品有限公司提供；小鼠前成骨细胞MC3T3-E1由上海生命科学研究院细胞资源典藏中心提供。

α-MEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、

磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、青霉素、链霉素、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均为细胞培养级） 美国Gibco公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、茜素红、氯化十六烷基吡啶（均为细胞培养级）、TritonX-100（分析纯）

美国Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒 碧云天生物技术研究所；小鼠Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ，COLⅠ）、骨钙素（osteocalcin，OCN）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TENSOR27傅里叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 德国Bruker公司；SMP7多功能酶标仪、TC10细胞计数器 美国伯乐公司；

Z326K低温离心机 德国Hermle公司；SW-CJ-2D双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；TV-1900双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；MCO-175二氧化碳恒温培养箱 日本Sanyo

公司；CKX 41SF倒置显微镜 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 POM-CP和POMCP-Zn的制备

珍珠贝外套膜胶原蛋白的提取参照Shen等[2]的方法，并稍作修改。低温下将外套膜去杂后，在4 ℃条件下用0.1 mol/L的NaOH浸泡48 h，每隔8 h换一次浸泡液，然后用去离子水冲洗至中性；随后将外套膜与水混合

（1∶8，V/V），于95 ℃条件下热提2 h，浸提液冷冻干燥后备用。所得胶原蛋白按照质量浓度10 mg/mL溶于去离子水中，用0.5 mol/L的NaOH调节pH值至8.0，添加酶活力单位为4 200 U/g胶原蛋白的胰蛋白酶，在50 ℃、120 r/min摇床中酶解5 h，之后沸水浴加热10 min终止酶解反应，酶解液冷冻干燥后制得POM-CP，随后采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定POM-CP的分子质量。

POMCP-Zn的制备参照Jiang Liangping等[20]的方法，并稍作修改。将1 mL质量浓度为100 mg/mL（0.734 mol/L）

的硫酸锌溶液添加到5 mL蛋白质质量浓度为30 mg/mL的POM-CP中；调节pH值至6.0，将混合物置于45 ℃恒温振荡摇床中反应30 min；添加纯乙醇，使得乙醇体积分数达到80%后，室温静置30 min，于8 000×g条件下离心15 min，去上清液，然后用纯乙醇反复冲洗沉淀物至无游离锌离子检出（双硫腙用作指示剂）；收集沉淀物干燥后保存，采用原子吸收光谱法测定螯合物中锌的含量[21]。

1.3.2 珍珠贝外套膜胶原蛋白的紫外光谱分析

取适量冻干后的珍珠贝外套膜胶原蛋白，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的水溶液，用蒸馏水做空白调零，在190～400 nm波长范围内对珍珠贝外套膜胶原蛋白溶液进行紫外扫描，记录不同波长下溶液的吸光度。

1.3.3 珍珠贝外套膜胶原蛋白的氨基酸组成分析

将珍珠贝外套膜胶原蛋白用6 mol/L的HCl浸泡于密封消化管中，110 ℃条件下减压处理，随后用HPLC仪进行测定。氨基酸含量表示为每1 000 个氨基酸残基中的残基数。

1.3.4 POM-CP和POMCP-Zn的FTIR分析

取适量干燥后的POM-CP和POMCP-Zn分别与干燥的20 mg溴化钾一起放入玛瑙研钵中，充分研磨、压片，最终为透明薄片，然后在4 000～500 cm-1波数范围内进行红外扫描，采用自動信息采集器收集信号。

1.3.5 细胞培养

小鼠前成骨细胞MC3T3-E1培养于含有10% FBS和100 U/mL青霉素和链霉素的α-MEM培养基中，于37 ℃、5%二氧化碳的湿润培养箱中培养。在细胞融合度达到90%时，采用0.25%胰酶-EDTA消化后进行细胞传代。

1.3.6 细胞增殖性测定

取对数生长期的MC3T3-E1细胞，利用细胞计数器将细胞浓度调整为1.5×104 个/mL，之后每孔100 μL接种于96孔板；于二氧化碳恒温培养箱中培养1 d后，弃去原培养液，换用含有不同质量浓度样品（POM-CP分别为0、50、100、200、300、400 μg/mL；POMCP-Zn分别为0、1、10、25、50、100 μg/mL）的生长完全培养基继续培养2 d。

细胞增殖性测定：每孔添加20 μL的MTT，培养4 h，随后弃去培养基，每孔添加150 μL的DMSO，充分溶解生成的蓝紫色甲瓒结晶，轻微振荡10 min后，利用酶标仪在490 nm波长处测定每孔的吸光度（A）。细胞增殖率按照下式计算。

1.3.7 细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性测定

取对数生长期的MC3T3-E1细胞，利用细胞计数器将细胞浓度调整为2.0×104 个/mL，之后每孔1 mL接种于24孔板；于二氧化碳恒温培养箱中培养1 d后，分别用含0、50、100、200、300、400 μg/mL的POM-CP和0、1、10、25、50、100 μg/mL的POMCP-Zn的分化培养基（其中包含10 mmol/L的β-甘油磷酸钠和50 μg/mL的抗坏血酸）干预7 d，每2 d更换一次分化培养基；培养结束后弃去培养液，细胞层用预冷的PBS清洗2 次，随后每孔加入200 μL细胞裂解液（1% TritonX-100），于4 ℃条件下裂解30 min；裂解物于4 ℃、12 000×g条件下离心5 min，取上清，采用对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）法检测ALP含量，BCA试剂盒测定其蛋白质含量。ALP活性用每克蛋白质释放的酶的活力来表示。

1.3.8 细胞COLⅠ和OCN分泌量测定

取对数生长期的MC3T3-E1细胞，利用细胞计数器将细胞浓度调整为2.0×104 个/mL，之后每孔1 mL接种于24孔板；于二氧化碳恒温培养箱中培养1 d后，用含0、10、25、50、100 μg/mL POMCP-Zn的分化完全培养基（其中包含10 mmol/L的β-甘油磷酸钠和50 μg/mL的抗坏血酸）干预7 d和14 d，每2 d更换一次分化培养基；培养结束后，收集培养液，参照ELISA试剂盒法检测COLⅠ和OCN的分泌量。

1.3.9 细胞矿化结节测定

取对数生长期的MC3T3-E1细胞，利用细胞计数器将细胞浓度调整为2.0×104 个/mL，之后每孔1 mL接种于24孔板；于二氧化碳恒温培养箱中培养1 d后，用含0、50、100 μg/mL POMCP-Zn的分化完全培养基（其中包含10 mmol/L的β-甘油磷酸钠和50 μg/mL的抗坏血酸）干预21 d，每2 d更换一次分化培养基；培养结束后将细胞用4%中性甲醛固定15 min，1%茜素红-Tris溶液染色30 min，去离子水清洗后，于倒置显微镜下观察并拍照。

半定量检测细胞矿化程度：加入100 mmol/L的氯化十六烷基吡啶溶解细胞中的茜素红，利用酶标仪在570 nm波长处测定每孔的吸光度。

1.4 数据处理

所有数据均表示为平均值±标准差。采用SPSS Statistics 19.0软件分析数据间的差异显著性，使用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 珍珠贝外套膜胶原蛋白的紫外光谱分析结果

大多数蛋白质在280 nm波长附近有很强的紫外吸收，这是由于蛋白质中含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分别在280、275、257 nm波长处有紫外吸收峰，而胶原蛋白中不含色氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸含量也很低，因此纯胶原蛋白溶液的紫外光谱扫描特征应该是在250～290 nm波长范围内基本无吸收峰，同时在230 nm波长以下有强吸收[22]。

由图1可知，珍珠贝外套膜胶原蛋白在204 nm波长处有最大吸收峰，而在280 nm波长附近无吸收峰，符合胶原蛋白的紫外吸收特征。

2.2 珍珠贝外套膜胶原蛋白的氨基酸组成

由表1可知：珍珠贝外套膜胶原蛋白的所有氨基酸中含量最多的是甘氨酸，约占氨基酸总量的30%；脯氨酸和羟脯氨酸的含量约占氨基酸总量的20%，具有胶原蛋白特有的性质；此外，珍珠贝外套膜胶原蛋白含有较高含量的谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸和亮氨酸。研究表明，金属螯合肽通常由谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸和亮氨酸等组成[23-25]。

本研究以珍珠贝外套膜为材料制备POM-CP和POMCP-Zn，HPLC法测得POM-CP的分子质量主要分布在500～10 000 Da之间，原子吸收光谱法测得螯合物中锌的含量为5.82×104 mg/kg，进而评价POM-CP和POMCP-Zn

对成骨细胞骨形成的作用。

2.3 POM-CP和POMCP-Zn的FTIR分析

由图2可知，POM-CP在1 655 cm-1处具有由于羰基伸缩振动和氨基弯曲振动所引起的特征吸收峰酰胺I带，然而，在POM-CP螯合锌离子后，该峰值转移到了较低的频率处，在POMCP-Zn中为1 639 cm-1处。这表明胶原蛋白肽中的羰基螯合了锌离子。此外，2 个较为明显的振动频率也发生了改变，在POMCP-Zn中羧基峰值从POM-CP的1 404 cm-1移动到了较低频率1 384 cm-1处，羟基峰值从POM-CP的3 408 cm-1移到了较高频率3 446 cm-1处。这些结果表明POM-CP主要通过肽键中的羰基氧、羧基氧和羟基氧与锌离子发生螯合反应。

由圖3可知，与空白对照组相比，质量浓度为50～400 μg/mL的POM-CP作用于MC3T3-E1细胞2 d后不能显著促进细胞的增殖，这与文献报道的牛、鱼、猪的胶原蛋白肽[26-27]在作用于MC3T3-E1细胞2 d时也不能影响成骨细胞的增殖相符合。与空白对照组相比，质量浓度为50 μg/mL的POMCP-Zn作用于MC3T3-E1细胞2 d时，细胞增殖率显著提高至126.93%。前期实验结果表明，不同剂量（0.1、1、5、10、15 μmol/L）的锌离子对成骨细胞的增殖促进作用不同，其中1 μmol/L锌离子的促进效果最佳，细胞增殖率提高至112.98%，但同时发现质量浓度继续升高后，锌离子的促进作用反而降低，由此可知，POMCP-Zn对成骨细胞的增殖促进作用明显优于锌离子。

2.5 POM-CP和POMCP-Zn对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

ALP可以降解钙化抑制因子，促使基质释放磷酸根离子，进而增加局部钙离子及磷酸根离子的浓度，促进基质矿化阶段钙化结晶的形成，因此其对成骨细胞的成熟和钙化有显著作用，是成骨细胞分化的标志性基因[28-29]。

由图4可知，当POM-CP质量浓度为300、400 μg/mL时，MC3T3-E1细胞的ALP活性分别显著提高至128%和131%，但与空白对照组相比，较低质量浓度（50～200 μg/mL）的POM-CP不能显著提高细胞的ALP活性。而POMCP-Zn展现出较强的促进ALP活性的作用。与空白对照组相比，较低质量浓度的POMCP-Zn对促进ALP的活性呈剂量依赖性，50 μg/mL的POMCP-Zn对ALP活性的促进作用最大，达162%，随后有所降低（质量浓度100 μg/mL）。此外，前期研究发现，与空白对照组相比，浓度为1 μmol/L的锌离子处理组MC3T3-E1细胞的ALP活性提高至108.34%，由此可知，锌离子不能显著促进成骨细胞的ALP活性，但肽-锌螯合物处理可以显著促进细胞的ALP活性。

上述结果表明，POM-CP不能促进成骨细胞的增殖，而质量浓度为10～100 μg/mL的POMCP-Zn对MC3T3-E1细胞的增殖具有显著促进作用。另外，在分化阶段，与锌离子和POM-CP相比，POMCP-Zn对MC3T3-E1细胞ALP活性的提高有更好的效果。因此，本研究选择POMCP-Zn进行下一步实验。

2.6 POMCP-Zn对MC3T3-E1细胞COLⅠ和OCN分泌量的影响

OCN是成骨细胞分化晚期的标志，是骨基质中含量最丰富的非胶原蛋白，对骨外基质中羟基磷灰石的结合和沉积具有重要作用。由图6可知，质量浓度为50 μg/mL的POMCP-Zn对OCN分泌的促进作用最强。干预14 d时，与空白对照组相比，50 μg/mL的POMCP-Zn处理组的OCN含量提高了239%。

上述结果进一步表明，POMCP-Zn能够促进骨胶原和非胶原蛋白的合成，从而上调成骨细胞分化。

2.7 POMCP-Zn对MC3T3-E1细胞矿化结节的影响

在细胞分化晚期，钙、磷等离子不断沉积，骨基质也逐步矿化成熟，形成骨矿化钙结节[31]。本研究采用茜素红染色来评价细胞外基质钙沉积物，进而探讨POMCP-Zn

对成骨细胞矿化结节的影响。由图7可知，用质量浓度为25、50 μg/mL的POMCP-Zn处理21 d后，MC3T3-E1细胞的钙结节数目显著多于空白对照组。半定量实验结果表明，与空白对照组相比，50 μg/mL的POMCP-Zn显著提高了成骨细胞的矿化能力（提高48.78%）。

3 结 论

本研究采用热水法提取珍珠贝外套膜胶原蛋白，通过紫外光谱扫描、氨基酸组成分析鉴定证明其符合胶原蛋白的基本性质；随后采用胰蛋白酶酶解得到POM-CP，

将其与锌离子螯合，得到肽锌螯合物POMCP-Zn；通过FTIR图谱分析得到，POM-CP主要通过肽键中的羰基氧、羧基氧和羟基氧与锌离子螯合；MTT实验结果表明，用质量浓度为0～400 μg/mL的POM-CP处理MC3T3-E1细胞2 d，对其增殖性没有显著影响，而POMCP-Zn具有显著促进MC3T3-E1细胞增殖的作用，并呈现剂量依赖关系；与空白对照组相比，50 μg/mL的POMCP-Zn对MC3T3-E1细胞的增殖率提高至126.93%；同时，POMCP-Zn也可以提高成骨细胞分化阶段的ALP活性、COLⅠ和OCN分泌量，促进成骨细胞矿化阶段骨结节的形成，推测与其螯合的锌离子有关。

综上所述，POM-CP对MC3T3-E1细胞的分化具有一定的作用，而POMCP-Zn能够促进成骨细胞增殖、分化及矿化，进而引起骨再生，POMCP-Zn有望成为治疗骨质疏松症的潜在功能性食品。

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