乳铁蛋白修饰的去氢骆驼蓬碱长循环磁纳米脂质体的制备和体外性质评价

王 梅， 唐小慧， 单 宇， 康莹莹， 王瑞珂

(新疆医科大学药学院, 乌鲁木齐 830011)

去氢骆驼蓬碱(Harmine, HM)为蒺藜科(Zygophyllaceae)植物骆驼蓬(PeganumharmalaL)的种子中提取出的一种β-咔保林类生物碱，研究表明，其药理作用十分广泛[1-3]。其中抗肿瘤作用受到广泛关注，研究表明去氢骆驼蓬碱对消化道癌、肝癌等多种癌症有效。另外，研究表明，去氢骆驼蓬碱很易透过血脑屏障，但去氢骆驼蓬碱大剂量用药后存在中枢神经毒副作用，应用后可引起震颤、惊厥、兴奋中枢，继而产生中枢抑制，甚至导致死亡，从而限制了其在临床的应用[4-5]。

磁纳米脂质体(Magnetoliposomes, ML)是将磁纳米粒包裹在脂质体的内水相或镶嵌在脂质双分子层内形成的磁纳米粒和脂质体“合二为一”的脂质体[6-7]，兼具磁纳米粒和脂质体的双重特性。一方面，纳米粒被包裹在脂质体内，可克服磁纳米粒体内易代谢、半衰期短的缺点，同时还可保留磁纳米粒所具有的磁靶向及局部热疗作用；另一方面，磁纳米脂质体仍具有脂质体的易于包载药物、靶向、缓释、提高药物稳定性、减少药物毒性等特点，磁纳米脂质体在肿瘤的治疗研究中已显示出良好的应用前景[8-10]。同时，采用乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf)作为脑靶向分子，可增加药物在肿瘤部位尤其是脑肿瘤部位细胞摄取[11-13]。

在以上基础上，本研究设计了一种乳铁蛋白修饰的长循环磁纳米脂质体，并将去氢骆驼蓬碱包裹在乳铁蛋白修饰的磁纳米脂质体内，旨在利用磁纳米粒的磁靶向和乳铁蛋白的分子靶向双重靶向以及脂质体的包裹作用，将去氢骆驼蓬碱富集到肿瘤细胞尤其是脑肿瘤细胞，杀灭脑肿瘤细胞，并降低药物的毒副作用。本研究制备乳铁蛋白修饰的去氢骆驼蓬碱长循环磁纳米脂质体，并对其形态、粒径、电位、包封率、释放度进行考察，以初步探讨制备乳铁蛋白修饰的去氢骆驼蓬碱长循环磁纳米脂质体的可行性。

1 材料

1.1仪器紫外可见分光光度计(UV-9100D，北京莱伯泰科仪器有限公司)； Malvern Nano-290型激光粒径测定仪(英国马尔文仪器有限公司)；KQ-50B超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；H -7650透射电镜(日本HI-TACHI)。

1.2药品与试剂去氢骆驼蓬碱(含量98.02%，南京泽朗医药科技有限公司，20140108)；大豆卵磷脂(上海金畔药业有限公司，20110216)；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC) (Avanti lipid Co.)；胆固醇(Avanti lipid Co.)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000)(Avanti lipid Co.)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物(DSPE-PEG-2000- COOH)(美国Nanocs)；柠檬酸包裹的磁纳米粒(粒径30nm,实验室自制)；其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1HM长循环磁纳米脂质体的制备称取大豆卵磷脂、DPPC、胆固醇、DSPE-PEG2000(质量比为10∶10∶5∶1)溶于体积比为2∶1的适量氯仿∶乙醚混合溶剂中，加入柠檬酸包裹的磁纳米粒水溶液5 mg及HM 2.5 mg，超声1～2 h，直至形成稳定的乳剂，减压蒸发除去有机溶剂，达到胶态后，加入少量水水化，继续减压蒸发除去残留溶剂，即得脂质体混悬液，将此混悬液室温放置3 h以上，依次通过0.45、0.22 μm微孔滤膜18～20次，即得去氢骆驼蓬碱长循环磁纳米脂质体。采用不同药脂比、不同磷脂和胆固醇用量分别制备HM长循环磁纳米脂质体，比较形成的各脂质体的包封率，以优化脂质体的处方。

2.2Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体制备称取大豆卵磷脂、DPPC、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-COOH (质量比为10∶10∶5∶1∶1)按“2.1”项下方法制备带有-COOH活性基团的HM长循环磁纳米脂质体。将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC:NHS:DSPE-PEG2000-COOH=30∶30∶3)加入上述脂质体中，室温下搅拌10 min。加入Lf，室温下孵育4 h，即得到Lf包裹的HM磁纳米脂质体。

2.3Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体形态、粒径、电位测定取Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体0.5 mL,加水稀释至2 mL，从中取1滴，滴于铜网上，晾干后采用透射电镜观察脂质体的形态。取Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体和未偶联Lf的HM长循环磁纳米脂质体各0.5 mL,分别加水稀释至2 mL，采用粒径测定仪测定各脂质体的粒径和电位。

2.4Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体的包封率测定

2.4.1 HM含量测定方法建立 精密称取HM标准品用甲醇溶解制得100 μg/mL标准贮备液，从中吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别用甲醇稀释，制得2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μg/mL系列标准品溶液。取10 μg/mL标准品溶液于200～400 nm范围内进行紫外扫描，取HM磁纳米脂质体和空白脂质体，分别用甲醇溶解后同法进行紫外扫描，结果标准品溶液和HM磁纳米脂质体均在299 nm有最大吸收，空白脂质体对测定干扰很小，故确定299 nm为检测波长。将各浓度标准溶液分别在299 nm处测定吸光度，以吸光度A值对浓度C作线性回归，得标准曲线方程，同时进行精密度、回收率考察，建立HM的含量测定方法。

2.4.2 超滤离心法测定包封率

2.4.2.1 空白脂质体透过能力考察 空白脂质体的透过能力考察采用磷脂与硫氰酸铁胺反应后的生成物在485 nm有最大吸收的原理进行测定。具体为：精密吸取空白脂质体0.5 mL加水2 mL稀释，置于超滤离心管以13 000 r/min离心20 min,取1 mL下层滤液于试管中，另取三氯化铁和硫氰酸铵配制显色剂，在下层滤液中加显色剂2 mL,补加氯仿，使试管中氯仿的最终体积为4 mL。置于旋涡混合器混合，再以2 000 r/min离心4 min,小心吸去上层溶液，取下层溶液，以氯仿为空白，在300～800 nm波长处扫描，在最大吸收波长处测定吸光度，如果未检测到磷脂吸光度，说明超滤膜可以完全截留脂质体。

2.4.2.2 包封率测定方法的回收率考察 精称HM 12.5 mg加水溶解，从中吸取0.3、0.5、1.0 mL，用甲醇稀释至10 mL，测定吸光度，计算含量，作为离心前的含量。另精密吸取HM溶液0.3、0.5、1.0 mL，各加空白脂质体0.5 mL,置于超滤离心管中，以13 000 r/min离心15 min，所得滤液加甲醇稀释至10 mL，测定吸光度，计算含量，作为离心后的含量，计算回收率。回收率计算公式为：

回收率=离心后含量/离心前含量×100%

2.4.2.3 超滤离心法测定脂质体包封率 精密吸取Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体0.5 mL，加水2 mL稀释后置于截留分子量为8 000的超滤管中，13 000 r/min离心15 min，取滤液1 mL加甲醇稀释至10 mL,置于UV上测定吸光度，计算含量，作为离心后游离药物的含量。精密吸取此脂质体0.5 mL，直接加甲醇破乳并定容至10 mL，置于紫外分光光度计上测定吸光度，计算含量，作为离心前药物总含量。包封率按下式计算：

包封率=(离心前药物总量-离心后游离药物含量)/离心前药物总量×100%

2.4.3 葡聚糖凝胶柱洗脱法测定Lf包裹的HM长循环磁纳米脂质体的包封率[14]

2.4.3.1 洗脱曲线的考察 取溶胀好的SephadexG-50(粒径100～300 μm)适量装柱，保持径高比为1∶10(cm∶cm)，用pH=7.2磷酸盐缓冲液平衡柱后，吸取0.5 mL脂质体液上柱用pH=7.2磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱流速为1 mL/min。收集洗脱液(2 mL/管)，所有洗脱液用甲醇溶解后，在299 nm下测定紫外吸收，代入标准曲线计算含量，以含量为纵坐标，洗脱流份为横坐标绘制洗脱曲线。

2.4.3.2 包封率测定方法的回收率考察 精密吸取0.5 mL含药脂质体上柱洗脱，收集脂质体流份，从脂质体流份中取0.5 mL再次上柱洗脱，接取二次过柱的脂质体流份，将二次过柱脂质体流份和首次过柱得脂质体流份分别用甲醇溶解，在299 nm下测定紫外吸光度，求算含量，按下式计算脂质体回收率，脂质体回收率(%)=二次过柱脂质体流份中药物含量/首次过柱脂质体流份中药物含量×100%。

2.4.3.3 Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体包封率的测定 取制备好的Lf包裹的HM磁纳米脂质体0.5 mL，上样于Sephadex G-50柱，用pH=7.2磷酸盐缓冲液洗脱，流速为1mL/min，接取第2～4管脂质体流份，加入甲醇破乳溶解，紫外分光光度法测定含量，作为纯脂质体中药物含量。另取0.5 mL Lf包裹的HM磁纳米脂质体直接加甲醇破乳溶解，紫外分光光度计测定吸光度，求算含量，作为脂质体中药物总量，按下式计算包封率。包封率计算公式为：

包封率=纯脂质体中药物含量/脂质体中药物总量×100%

2.5Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体的释放度测定精密吸取5 mL HM磁纳米脂质体装入截留分子量为12 000的透析袋中，用封口夹夹住透析袋两端，置于溶出仪中，加入2 00 mL pH=7.2磷酸盐缓冲液作为释放介质，37℃下匀速转动。于10、20、30 min及1、2、3、4、6、8、24、48、72 h各取样2 mL，并同时补加等量pH=7.2磷酸盐缓冲液，样品用甲醇溶解后，在299 nm处测定吸光度，求算平均累积溶出百分率，以平均累积溶出百分率为纵坐标，释放时间为横坐标，绘制释放曲线。另精密称取等量去氢骆驼蓬碱原料药，用pH=7.2磷酸盐缓冲液溶解后，装入透析袋，同法进行释放度测定，以进行比较。

3 结果

3.1脂质体形态、粒径、电位测定采用透射电镜法测定去氢骆驼蓬碱磁纳米脂质体的形态，结果见图1。粒径测定仪测定脂质体的粒径和电位，结果见表1、图2、图3。

3.2Lf修饰的HM磁纳米脂质体的包封率

3.2.1 HM含量测定方法建立 经过最大吸收波长检测、标准曲线制备、精密度和回收率考察，确定紫外分光光度法测定HM含量。最大吸收波长为299 nm，标准曲线方程为C=11.289A-0.282 6(r2=0.999 2),日内、日间精密度和加样回收率RSD值均<2%，平均回收率为(100.64±4.61)%。

Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体(×60 000)

空白脂质体(×30 000)

图1 Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体和空白脂质体形态

图2 HM长循环磁纳米脂质体的粒径分布

3.2.2 超滤离心法测定Lf修饰的HM磁纳米脂质体的包封率

3.2.2.1 空白脂质体透过能力考察 将空白脂质体超滤离心后，收集下层滤液，进行磷脂紫外光谱扫描，结果见图4。由结果可知，扫描图中未见最大吸收波长，吸光度基本接近于零，说明下层滤液中无空白脂质体，脂质体可以和游离药物分开。

3.2.2.2 超滤离心法测定包封率回收率考察 回收率考察结果发现，回收率在87.65%～104.7%之间，回收率变异较大。表明该法不适用于Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体的包封率测定。

3.2.3 葡聚糖凝胶柱洗脱法测定Lf包裹的HM磁纳米脂质体的包封率

3.2.3.1 洗脱曲线的考察 结果见图5，由洗脱曲线结果可知，脂质体流份在第2～4管流出。脂质体和游离药物可以很好地分开。

3.2.3.2 包封率测定方法的回收率考察 结果见表2。由结果可知，用Sephadex G-50柱洗脱法测定脂质体的包封率，其回收率变异较小，回收率较高，表明该法可做为Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体的包封率测定方法。

表2 包封率测定方法回收测定结果(n=3)

3.2.3.3 葡聚糖凝胶柱洗脱法测定包封率 采用葡聚糖凝胶柱洗脱法测定脂质体的包封率，通过比较不同磷脂、胆固醇比例和不同药脂比条件下所制得的HM长循环磁纳米脂质体的包封率结果，见图6，可知在磷脂、胆固醇比例为10∶10∶5∶1，药脂比为1∶20的处方条件下，所制得的3批HM长循环磁纳米脂质体的包封率最高，但考虑载药量的大小，药脂比1∶10的载量量要高于1∶20，因此最终选择磷脂、胆固醇比例为10∶10∶5∶1，药脂比为1∶10的处方为制备HM磁纳米脂质体最佳处方。通过比较HM磁纳米脂质体和Lf修饰后的HM磁纳米脂质体包封率值，结果修饰后包封率可达(71.28±2.94)%，未修饰HM磁纳米脂质体包封率为(66.20±12.32)%，两者结果无统计学差异(P>0.05)，说明Lf修饰不会影响脂质体的包封率。

3.3Lf修饰的HM磁纳米脂质体的释放度测定Lf修饰的HM磁纳米脂质体的释放度测定结果见图7。由结果可知，脂质体与游离药物相比，游离药物在数小时内释放即已完全，而脂质体在24 h后释放才基本完全。表明药物制成脂质体后，释药更加缓慢,Lf修饰的HM磁纳米脂质体与未修饰HM磁纳米脂质体相比，释药更加缓慢。

图6 不同磷脂、胆固醇比、药脂比的包封率(n=3)

图7 Lf修饰的HM磁纳米脂质体的释放曲线 (n=3)

4 讨论

本实验采用逆相蒸发法制备了Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体，并对其体外性质进行了考察。结果证实脂质体已形成，对Lf包裹前后脂质体的粒径、电位进行测定，其粒径结果分别为240.5 nm，407.8 nm，脂质体荷负电。采用两种方法测定了脂质体的包封率。其中经测定，超滤离心法测得脂质体的包封率为(85.75±4.57)%，但因在对包封率测定方法的回收率考察中发现，回收率变异较大，且当超滤的样品量达到2 mL时，回收率超过100%，经过多次测定，回收率依然不能达到100%，因此本文未选用超滤离心法测定脂质体的包封率。本文采用葡聚糖凝胶柱洗脱法测定Lf包裹的HM磁纳米脂质体的包封率，该测定方法回收率高，洗脱曲线表明脂质体与游离药物已分开，且该法简便易行，可作为脂质体包封率测定方法。经测定Lf修饰的HM长循环磁纳米脂质体包封率可达(71.28±2.94)%。Lf修饰前后包封率变化不大，说明Lf修饰基本不会影响药物的包封率。最后经脂质体释放度考察，表明脂质体与原料药和未修饰的磁纳米脂质体相比，释药更加缓慢，说明该法制得的脂质体具有一定的缓释作用。

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